甲型流感病毒核糖核蛋白复合物的纯化与可视化
2009年2月9日
甲型流感病毒的基因组由八个独立的RNA和蛋白质复合物组成，称为病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。本文介绍了甲型流感病毒vRNPs的甘油梯度纯化及其透射电子显微镜观察方法。
本实验首先通过离心去除甲型流感病毒溶液中的任何碎片。然后使用去污剂破坏病毒膜，并通过甘油梯度分离释放出的病毒核蛋白复合物（vR NPs）。
从梯度中收集离心后的各组分，并取每种组分的等分试样进行SDS-PAGE分析。使用考马斯亮蓝对凝胶染色，以确定含有VNPs的峰值组分。含有VNPs的组分随后通过离心浓缩，将纯化的VRPs加样至铜制透射电镜载网，然后进行负染色，以便通过透射电子显微镜观察VRPs。大家好，我是WinCo Wu，来自不列颠哥伦比亚大学动物学系Nellie Pane博士的实验室。
我是Lindsay Weaver，曾就职于Pane实验室。今天我们将向您展示一种纯化流感病毒核糖核蛋白复合物的实验方法。在我们的实验室中，该方法用于研究甲型流感病毒在组织培养细胞中的核内输入过程。
下面我们开始实验。首先，将750微升MNT缓冲液加入一支11毫米×34毫米的Beckman聚碳酸酯离心管中。接着，向管中加入500微升浓度为2毫克/毫升的甲型流感病毒溶液，用移液器上下吹打数次，使病毒与MNT缓冲液充分混匀。
混匀后，将离心管放入TLA120.2转子中，在Beckman Optima max E离心机中于4°C、109,000 ×g条件下离心10分钟。离心结束后，弃去上清液，将沉淀重悬于500 µL裂解缓冲液中，充分涡旋混匀，然后在Eppendorf Thermomixer中于31°C振荡孵育20分钟。
振荡完成后，进行甘油梯度沉降速度离心。制备甘油梯度时，将以下液体加入贝克曼（Beckman）UltraClear 13 毫米 × 51 毫米离心管中：1 毫升 70%（体积比）甘油、0.75 毫升 50% 甘油、0.375 毫升 40% 甘油，以及 1.8 毫升 33% 甘油。这些甘油溶液通过将纯甘油与 NM 缓冲液混合配制而成。
同时准备一支含有甘油和缓冲液的平衡管。然后再次涡旋振荡已破碎的病毒样品，并将其加样至甘油梯度中。将离心管放入贝克曼MLS 50 摆动桶转子中，在4°C条件下以217,000 ×g离心3小时45分钟。
离心结束后，从离心管顶部开始，手动收集250微升的梯度组分。将各组分置于冰上或4°C保存。收集完所有组分后，即可使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳对其进行分析。
开始进行SDS-PAGE分析时，从每份组分中取出20 µL转移至新的离心管中。然后加入5 µL的5倍浓度SDS-PAGE上样缓冲液，将样品在95 °C加热5分钟。加热后，短暂离心样品，随后将其上样到10%聚丙烯酰胺凝胶中，并在其中一个加样孔中加入分子量标记物。接着电泳运行样品，直至溴酚蓝上样染料迁移至凝胶底部附近。
从SDS-PAGE装置中取出凝胶，并用考马斯亮蓝对凝胶进行染色。根据染色结果，鉴定主要含有甲型流感病毒核蛋白的组分。
流感病毒A型NP的分子量约为56千道尔顿，是病毒核糖核蛋白复合物中的主要蛋白。因此，在含有VRNP的组分中，NP条带通常是条带最强的一条。在下一部分中，我们将对这些VRNP组分进行浓缩。
合并主要含有NP的甘油组分，并将其分装到两个Beckman 11毫米×34毫米的聚碳酸酯离心管中，每管用焦碳酸二乙酯（DEPC）处理的超纯水或乙基焦碳酸酯填充。然后上下吹打数次以混匀。将离心管放入Beckman TLA 120.2转子中，在4°C条件下以157,000 ×g离心4.5小时。
离心结束后，弃去上清液并重悬沉淀。用 50 µL 经 DEPC 处理的水将纯化的 V NPS 分装，其中一份留作备用，其余分装样品于 -80 °C 保存。现在我们已准备好进行 VRPs 的负染色操作。
将一微升纯化的病毒核糖核蛋白（VRNP）加入九微升新鲜配制并经过两次过滤的PBS缓冲液中进行稀释，随后对铜制透射电镜样品载网进行30秒的辉光放电处理。该载网先前已镀有帕洛伊丁（Parlow Dion）和碳膜。用镊子夹住经辉光放电处理后的样品载网，将五微升稀释后的VRNP溶液滴加到载网上。
等待期间，让液滴在载网上吸附八分钟。将一小条滤纸放入托盘中，然后在滤纸上滴加两滴 PBS 缓冲液，每滴 10 微升，以及一滴 80 微升的新鲜配制染色液，染色液由 1% 的甲胺银溶液组成。接着，将样品载网小心地浸入 PBS 的两滴液滴中，清洗总时长为一分钟。
然后用一片滤纸从样品载网上吸去部分溶液，注意不要让样品载网干燥。在从样品载网上吸去最后一滴缓冲液后，立即将样品载网完全浸入染色液滴中，并等待一分钟。
一分钟后，使用新的滤纸将染色液从样品载网上彻底吸除。让样品载网在观察前晾干数分钟。在透射电子显微镜下，以下是经负染色的 V 纳米颗粒的代表性透射电子显微镜图像。
如您在此处所见，病毒核蛋白复合物（V NPS）呈杆状颗粒，长度可变，约为30纳米至120纳米。寡聚核蛋白（NP）以核蛋白分子链的形式排列，并进一步折叠成双螺旋重复结构，因此在这些杆状颗粒的两端有时可见环状结构。
我们刚刚向您展示了如何纯化和观察流感病毒A的核糖核蛋白复合物。在进行此操作时，如果您使用醋酸铀对VR mps进行负染色，则在稀释时切勿使用PBS。
以上就是全部内容。感谢观看，祝您的实验顺利成功。
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概述
本研究聚焦于甲型流感病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）的纯化与可视化。该方法涉及通过离心和透射电子显微镜技术对vRNPs进行分析。
关键研究组成部分
科学领域
- 病毒学
- 细胞生物学
- 显微镜技术
背景
- 甲型流感病毒基因组由八个RNA和蛋白质复合物组成。
- 理解病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）对病毒学研究至关重要。
- 透射电子显微镜是观察病毒结构的关键工具。
- 纯化技术可提高实验结果的清晰度。
研究目的
- 纯化甲型流感病毒vRNP，以进行深入研究。
- 利用电子显微镜观察vRNP的结构。
- 改进病毒组分研究的方法学。
使用的方法
- 通过离心去除流感病毒溶液中的碎片。
- 使用去污剂破坏病毒膜。
- 在甘油梯度中分离病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。
- 利用透射电子显微镜观察纯化的vRNPs。
主要结果
- 成功从甲型流感病毒中纯化出病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）。
- 通过SDS-PAGE鉴定含有vRNPs的峰值组分。
- 在透射电子显微镜（TEM）载网上清晰观察到vRNPs的形态。
- 为后续病毒组分研究建立了可靠的方法学基础。
结论
- 该研究提供了一种可靠的方法，用于纯化和可视化甲型流感病毒vRNP。
- 研究结果有助于深入理解流感病毒的结构。
- 未来的研究可基于这些方法进一步开展病毒学相关研究。
常见问题
行业应用价值
纯化甲型流感病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）可通过从病毒颗粒组分中分离出具有功能的复制机器，从而在抗病毒靶点验证中实现机制层面的风险降低。该方法通过提供一个与疾病相关的系统来研究核输入和基因组复制过程，避免了病毒结构蛋白的干扰，从而增强了早期发现阶段的预测可信度。该技术通过标准化、可重复的vRNP制备，促进流感治疗药物的检测方法开发和筛选前准备工作。
生物制药研发中的战略应用
早期发现与靶点验证
- 科学价值：通过分离病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs），可研究核输入机制和流感病毒基因组复制，从而验证治疗假设。
- 操作价值：提供一个纯化的系统，减少靶点验证实验中机制上的不确定性。
- 预测价值：通过提供与疾病相关的vRNPs用于功能分析，支持临床前模型的建立。
筛选与检测方法开发
- 科学价值：可制备标准化的病毒核糖核蛋白复合物（vRNP），适用于后续生化及基于细胞的检测实验。
- 操作价值：通过非连续甘油梯度离心分离结合SDS-PAGE组分验证，确保实验的可重复性。
- 可扩展性：利用高速离心进行浓缩，可合并洗脱峰组分，从而获得稳定一致的实验输入材料。
转化与临床前研究
- 转化连续性：经负染透射电子显微镜验证，纯化的vRNP保持结构完整性，支持其在临床前研究中的有效性验证。
- 机制去风险化：观察到棒状vRNP（30–120 nm）的存在，证实核蛋白结构得以保留，从而降低机制研究中出现假阴性结果的风险。
- 预测可靠性：可对化合物在vRNP核转运及复制通路中的功能影响进行可靠评估。
流程与工作流整合
病毒核糖核蛋白（vRNP）纯化流程适用于流感抗病毒药物研发的全过程，涵盖靶点验证、先导化合物筛选到临床前评估，为机制性和表型筛选提供标准化的输入材料。
- 发现生物学：通过递送分离的vRNPs，支持对核输入抑制剂和复制阻断剂的假设验证。
- 筛选：通过SDS-PAGE和透射电子显微镜（TEM）产生可用于检测的vRNPs，并实现化合物效应的定量输出。
- 分析：利用梯度分离和染色技术，对不同条件下vRNP的产量、纯度和完整性进行定量比较。
- 转化研究：保持vRNPs的结构保真性，以确保在流感致病机制的临床前模型中的一致性。
- 企业级复用：建立可重复使用的平台，用于跨多个项目和治疗模式的流感vRNP生产。
运营与企业影响
- 科学价值：通过消除以病毒核糖核蛋白复合物（vRNP）为靶点的检测中病毒颗粒组分的干扰，提高靶点验证的可信度。
- 操作价值：通过标准化的密度梯度纯化与浓缩步骤，实现可重复且可放大的vRNP制备。
- 战略价值：通过降低流感机制研究中的生物学风险，优化抗流感项目的推进或终止决策。
- 项目组合影响：基于经验证的vRNP活性，支持对抗病毒候选药物进行风险调整后的优先级排序。
实施注意事项
- 需要具备超速离心、梯度制备和负染透射电子显微镜技术的专业知识。
- 依赖于摆动桶转子、TLA转子、超速离心机以及透射电子显微镜（TEM）设施的可及性。
- 需要在不同团队之间对裂解缓冲液、甘油梯度配方和染色方案进行标准化。
- 应用于其他病毒系统时，可能需要优化梯度浓度和离心参数。
- 实际限制因素包括梯度组分收集所需时间以及病毒核糖核蛋白复合物（vRNPs）对冻融循环的敏感性。
生物制药常见问题
Chapters in this video
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Title
0:58
Introduction
1:27
Disruption of the Influenza A Virion
2:53
Glycerol Gradient Sediment Velocity Centrifugation
4:18
Analysis of the Glycerol Gradient Fractions by SDS Polyacrylamide Gel Electrophoresis
5:40
Concentration of the vRNP Fractions
6:39
Negative Staining of vRNPs
8:25
Representative Results/ Outcome
9:05
Conclusion
