基于双元细菌人工染色体载体的拟南芥基因转化：一种产生单拷贝插入转基因植株的技术

从...开始 拟南芥 带有未成熟花序的植株。将花序浸入 农杆菌 携带克隆有双元细菌人工染色体（BIBAC）的T-DNA的细胞悬液，BIBAC是一种可在两种生物中复制的载体 E. coli 和 农杆菌 系统。该T-DNA双元载体可递送包含除草剂抗性基因和荧光筛选标记的大片段转基因，且可与种子特异性启动子共同使用。

在花序仍浸没时，轻轻搅动植株以增强其与溶液的接触 农杆菌凭借其固有的感染植物能力， 农杆菌 将转基因导入花细胞。当转基因进入细胞后，会移向细胞核，并与植物基因组融合。

现在，用保鲜膜包裹植物，并在黑暗条件下孵育，以保持湿度，提高转化效率。去除保鲜膜后，将植物在生理条件下培养，直至其产生种子。

接下来，收获种子并在荧光显微镜下观察，以筛选转化子。随后，将转化后的种子在适宜条件下培养至萌发。用除草剂喷洒植株，并进行培养。

含有多个转基因插入的植株会出现基因沉默并枯萎，而含有单拷贝插入的植株则表达具有活性的除草剂代谢酶，并能在处理中存活。从存活的转化植株中提取基因组DNA，并通过PCR分析单拷贝插入的效率。

准备 拟南芥 用于转化的植物，培养 拟南芥 在温室或气候可控的生长室中培育植物，直至其开花。剪除最初的主花序，以促进更多侧花序的产生。剪除后4至6天，当植株上具有大量未成熟花序而受精角果较少时，即可进行浸花处理。

进行花序浸蘸时，将花序浸入溶液中5到10秒 农杆菌 悬浮液。轻轻振荡。用保鲜膜包裹植物的地上部分以保持高湿度，并用盒子盖住花盆使植物处于黑暗环境中。

在温室或人工气候室中培养植株两天。两天后，移除盒子和保鲜膜，继续在温室或人工气候室中将植株培养至成熟。为提高转化效率，可在首次浸染七天后对同一植株进行再次浸染。

接下来，当转化植株成熟并干燥后，收获种子。将同一构建体转化的植株种子合并，作为一个组合进行分析。若植株是用BIBAC-RFP-Gateway质粒衍生物转化的，则通过荧光显微镜观察种子来鉴定转基因植株。

为了检测种皮中的DsRed表达，使用560纳米激发光，600至650纳米发射光对种子进行成像。使用镊子将发出荧光的种子与不发荧光的种子分离开。

为了筛选转化了BIBAC-BAR-Gateway质粒衍生物的转基因植株，将种子播种于装有土壤的育苗盘中。将种子悬浮于0.5X MS培养基中的0.1%琼脂溶液内，用1毫升移液器将种子均匀铺布于育苗盘中，以确保种子分布均匀。

通过将种子在4摄氏度下孵育至少两天，以诱导种子同步萌发。此步骤可在播种前或播种后进行。播种后两周和三周时，用0.5%的草铵膦铵溶液喷洒幼苗，每1平方米使用500毫升草铵膦铵溶液。将存活的幼苗转移至花盆中。通过PCR分析抗草铵膦铵的植株中目标载体的存在情况。