高效共表达多种嵌合荧光融合蛋白的植物方法

该方法有助于解答植物分子与细胞生物学领域的关键问题，例如，我们如何研究细胞内的蛋白质。此技术的主要优势在于，能够在单一表达载体中高效共表达细胞融合蛋白。本实验操作将由本实验室的研究生Guitao Zhong进行演示。

首先，按照文本方案中所述设计用于DNA片段分子克隆的引物。使用相应的引物和高保真聚合酶，通过标准PCR反应扩增构建半独立蛋白表达盒所需的DNA片段，包括启动子、荧光报告基因、目的基因和终止子。

通过使用1%琼脂糖凝胶进行DNA电泳，检测第一轮PCR产物的质量，观察是否存在DNA降解及污染。使用分光光度计对PCR产物进行定量。PCR产物在260和280纳米处的吸光度比值应在1.6至1.8之间。

将为同一蛋白表达盒设计的DNA片段混合至一个PCR管中，总体积为五微升。关于混合来自不同表达盒数据的DNA。由于需要连接的DNA分子数量增加，等量混合会降低DNA组装的效率。

现在，向5微升DNA混合物中加入15微升2x主混合液，在50摄氏度下孵育60分钟。通过第二轮PCR扩增整个半独立的蛋白质表达盒。以第一轮等温组装反应产物的0.5至1微升作为模板，使用最外侧的引物进行扩增。

在50微升反应体系中使用一个单位的高保真聚合酶进行30个循环，随后在68摄氏度下延伸5分钟。接下来，在终体积为10微升的反应体系中加入4个单位的小一酶，线性化最终的蛋白表达骨架载体POC 18和载体CAMBIA 1300。这些载体设计用于蛋白瞬时表达和遗传转化。

在25摄氏度下孵育限制性酶切反应一至两小时。酶切完成后，于65摄氏度孵育20分钟以灭活限制性内切酶。接着，将等摩尔量的蛋白表达盒DNA分子与线性化的终末载体混合，总体积为五微升。

最后，通过将反应物与15微升2x主缓冲液混合，并在50摄氏度孵育60分钟，进行第二轮DNA重组。为准备用于轰击的烟草BY-2悬浮细胞，将30毫升培养3天的BY-2细胞用真空泵过滤收集到一张70毫升已灭菌的滤纸上，真空压力设置为40毫巴。同时，在培养皿中加入数滴BY-2细胞液体培养基。

将带有BY-2细胞的滤纸转移至培养皿中。为准备拟南芥幼苗进行微粒轰击，按照文本方案中的详细步骤准备七日龄的样品植株。然后将其转移至新的半倍浓度MS培养基平板中央的矩形区域，以提高轰击效率。

转移和放置植株到培养板上时，注意避免植株相互重叠。在植株或组织表面加入数滴半浓度的MS液体培养基，以保持湿度，防止后续操作过程中植株失水干燥。为使金微粒包被质粒DNA，首先将金微载体溶液充分涡旋振荡3分钟。

现在，将25 µL金颗粒加入一个新的1.5 mL离心管中，涡旋振荡10秒。加入10 µL浓度为25.46 mg/L的亚精胺，涡旋振荡10秒。接着，加入5 µL浓度为1 µg/µL的质粒DNA，涡旋振荡3分钟。

最后，加入25微升浓度为277.5毫克/升的氯化钙溶液，涡旋混匀1分钟。使用台式离心机以最大速度离心5秒，使金微载体沉淀。离心后，小心移除上清液，注意不要扰动沉淀物。

接着，用200微升无水乙醇洗涤沉淀，通过涡旋振荡5至10秒重新悬浮沉淀。再次以最大速度离心金微载体5秒，弃去乙醇。将金颗粒重新悬浮于18微升无水乙醇中。

然后，取六微升颗粒悬浮液，分别滴加到三个微载体的中央，使其自然风干。为通过粒子轰击将DNA转入细胞和植株，首先按照文本方案中所述设置粒子递送系统。随后，在农杆菌共培养平板上，于三个不同位置对细胞或植株进行三次轰击。

在观察荧光信号前，将轰击后的细胞和植株置于植物培养箱中避光培养6至72小时。将植物培养箱设置为持续黑暗条件，温度为22摄氏度。将幼嫩植株或悬浮细胞转移至普通玻璃载玻片上，轻轻盖上盖玻片，用于标准共聚焦激光扫描显微镜成像。

根据文本方案中列出的设置，在 485 纳米处激发 GFP 标记的蛋白质，并在 525 纳米处检测荧光信号。对于 RFP 标记的蛋白质，在 585 纳米处激发，并在 608 纳米处检测荧光信号。最后，按照文本方案中所述方法计算荧光信号的共定位比率。

通过微粒轰击法在烟草BY-2细胞中实现了拟南芥VSR-2与拟南芥SCAMP4的共表达，并显示出正确的定位。RFP标记的拟南芥VSR-2呈现点状分布模式，与定位于质膜的拟南芥SCAMP4-GFP不同，后者在细胞质中可见一些点状结构。此外，通过农杆菌介导的转化方法获得了共表达拟南芥SCAMP4-GFP和RFP标记的拟南芥VSR-2的拟南芥转基因植株。

展示了两种嵌合蛋白在根细胞和根毛细胞中共表达时的亚细胞定位。与先前的研究一致，转基因拟南芥经处理后，RFP标记的拟南芥VSR-2定位于前液泡区室，形成小的环状结构；而经prefoldin A处理则诱导了GFP标记的拟南芥SCAMP定位于反式高尔基体网络并发生聚集。

作为阴性对照，在相同成像条件下，烟草 BY-2 细胞以及拟南芥根和根毛细胞中几乎观察不到自发荧光信号。该方法可帮助了解蛋白质的亚细胞定位，也可用于研究蛋白质的作用方向。

该技术问世后，为植物细胞生物学领域的研究人员开辟了新的途径，可方便地研究活体植物细胞中蛋白质的亚细胞定位及其空间相互作用。在此基础上，还可进一步采用PET介导的转化和遗传杂交等方法，以回答其他科学问题，例如如何在植物中共同表达多种融合蛋白。

请注意，进行轰击操作可能具有极高危险性，执行该步骤时应始终采取防护措施，例如佩戴护目镜。