基于薄层色谱的酶活性检测法：利用薄层色谱测定体外焦磷酸激酶活性的技术

焦磷酸激酶催化二磷酸或焦磷酸基团从核苷酸前体（如三磷酸腺苷ATP）转移至底物（如二磷酸鸟苷GDP），从而形成四磷酸鸟苷——一种重要的信号分子。

为了测定焦磷酸激酶活性，配制含有GDP和放射性标记ATP的反应混合物，溶于添加了氯化镁的适当缓冲液中。向反应混合物中加入所需量的焦磷酸激酶，并进行孵育。

随着时间的推移，在镁离子存在的情况下，焦磷酸激酶开始将ATP上的放射性标记焦磷酸基团转移至GDP，生成放射性鸟苷四磷酸。

现在，取一块预先涂有聚乙烯亚胺-纤维素（一种基于阳离子聚合物的固定相）的薄层色谱（TLC）板。在不同时间点，将反应混合物分析物的等分试样点样于TLC板底部附近，以终止反应并评估反应进程。

将平板浸入含有磷酸二氢钾（一种流动相溶剂）的玻璃室中。随着溶剂前沿向上移动，带负电荷的分析物会根据其与带正电荷的固定相之间的亲和力开始迁移。

不同磷酸化程度的分析物因其负电荷和分子量的差异，决定了它们在薄层色谱板上的相对迁移位置，从而固定形成不同的条带。

当溶剂前沿到达预定距离时，取下薄层板并晾干。测量放射性信号强度，该信号对应于放射性标记的ATP消耗和鸟苷四磷酸的积累，用于分析焦磷酸激酶活性。

在进行反应之前，通过将PEI-纤维素薄层色谱板浸入去离子水中进行预处理。将色谱板放入盛有重蒸水的玻璃展开槽中，水深约0.5厘米。待水迁移至色谱板顶端后，将色谱板从玻璃展开槽中取出，置于实验台上的支架上，过夜晾干。

用软铅笔在干燥的薄层板一端距边缘2厘米处做标记，以指示样品在薄层色谱（TLC）中的点样位置。对于2 µL的样品，点样位置之间的间距不得小于1厘米。设计实验时，应始终在每块板上留出一个未使用的点样位置，作为样品定量时的空白对照条带。

进行酶活性测定实验时，按照文本方案中的描述，使用 γ-³²P-ATP 分别配制各个反应体系。在其他组分混合后再加入 RSH，因为将 RSH 加入含有核苷酸的混合液即启动酶活性测定反应。

为排除核酸酶污染导致的ATP水解，设置一个不含蛋白质的10微升反应体系，并平行孵育。在 t = 0 和实验结束时分别取2微升样品点样，以确认在无蛋白质条件下ATP未发生水解。

加入 RSH 后立即取出 2 微升，点样到标记好的 PEI-纤维素板上，作为 t = 0 分钟的样品。

在37摄氏度下孵育反应，在预定的时间点取出2微升等分试样。收集完所有等分试样后，通过向层析 chamber 中加入1.5摩尔的磷酸二氢钾溶液至0.5厘米深度来填充，进行薄层层析。将板的底边浸入溶剂中，使溶剂在约90分钟内迁移至板的顶端。

将薄层板从层析缸中取出，放置在实验台上的干燥架上，室温下晾干过夜。薄层板干燥后，用塑料薄膜包裹，以防止放射性物质转移到成像暗盒中，然后进行放射自显影分析。

将含有已分离反应产物的PEI-纤维素板在室温下暴露于磷屏成像仪暗盒中4小时。曝光结束后，使用磷屏成像仪对暗盒进行成像。

使用具有图形用户界面的成像软件，首先选择“绘制矩形”，然后使用鼠标围绕整条泳道以及该泳道内的ATP和四磷酸鸟苷斑点绘制矩形感兴趣区域（ROI）。

使用“选择、复制和粘贴”命令在其他泳道中绘制相同的感兴趣区域（ROI），以确保各泳道中的ROI测量的是相同面积内的信号。包含一个未使用泳道的ROI作为空白对照。

使用成像软件的“分析 | 工具 | ROI 管理器 | 添加”命令，选中绘制在 PEI-纤维素板上的所有 ROI。接着，使用“分析 | 设置测量 | 测量”命令，量化每个 ROI 内的信号强度，并将测量结果导出为电子表格。在电子表格中，从实验信号中减去空白 ROI 的数值。