通过薄层色谱法分析分枝杆菌的脂质组成

分枝杆菌的脂质是该属的重要特征，在分枝杆菌与宿主的相互作用中起关键作用。该方法的主要优点是快速且具有高度灵活性。此方法可用于研究脂质在分枝杆菌致病性及其免疫刺激效应中的作用。

对于非共价连接脂质的提取，在层流罩中向带有聚四氟乙烯衬里螺旋盖的玻璃管中加入15毫升氯仿与甲醇体积比为1:2的溶液。然后，从固体培养基上刮取200毫克分枝杆菌，并将分枝杆菌加入该玻璃管中。将试管在持续搅拌条件下孵育过夜。

第二天，将有机溶剂通过铺有滤纸的玻璃漏斗过滤至玻璃试管中。使用氮气吹扫以蒸发试管中的液相，然后向试管中充入氮气，并在4摄氏度条件下保存。随后，向细胞碎片中加入15毫升体积比为2:1的氯仿-甲醇溶液，持续搅拌并过夜孵育。

次日早晨，先让混合物静置一小时，然后使用巴斯德移液管将有机溶剂转移至铺有滤纸的玻璃漏斗中，收集到同一根玻璃收集管内。随后，按所示方法蒸发液相，再用氮气重新填充试管，并于4°C条件下保存。对于分枝菌酸提取，向带有聚四氟乙烯（PTFE）衬垫螺帽的密闭玻璃管中加入2至5毫升搅拌溶液以及200毫克分枝杆菌生物量，通过涡旋振荡混合管内物质。

将混合物置于干燥浴中，在 80 摄氏度下孵育过夜。第二天，待试管冷却至室温后，加入 2 毫升正己烷，并通过涡旋振荡混合 30 秒。静置试管，直至出现两层清晰的相，然后将上层的正己烷相转移至新试管中。

向试管内容物中再加入两毫升正己烷，再次收集上层液体。然后，用氮气吹干试管中的内容物，并将样品在氮气保护下于4°C保存，如图所示。为通过薄层色谱（TLC）分析样品，先在TLC展开槽内壁一侧贴上一张滤纸，于展开槽四角涂抹凡士林以密封槽体，将溶剂混合物沿滤纸壁缓慢加入，并将剩余溶剂加至TLC展开槽底部。

关闭薄层色谱（TLC）展开槽至少20分钟以使其饱和。在此期间，将玻璃管中的脂质溶解于200至1000微升氯仿中，并用毛细玻璃管吸取10微升脂质氯仿悬液，直接点样到TLC板上。待样品干燥5分钟后，将TLC板放入已饱和的展开槽中，使流动相沿TLC板展开。

当溶剂迁移至距离板上端1厘米处时，将板置于层流通风橱中，直至硅胶完全干燥。然后，用15至20毫升的10%摩尔浓度磷酸二水合物乙醇溶液均匀喷洒干燥的板，直至板面呈现亮黄色，并在120摄氏度下加热2至5分钟。在此代表性分析中，通过一维薄层色谱法（使用两种不同的洗脱体系）以及二维薄层色谱法，对从不同分枝杆菌种类中提取的分枝菌酸进行了分析。

还进行了两种甲基化处理，以确认五型分枝菌酸的存在。在两种洗脱体系中，分枝菌酸均大致位于板的中部，但五型分枝菌酸对应的斑点仅在皂化后观察到。二维薄层色谱法还可用于鉴定不同类型的分枝菌酸。

例如，Mycobacterium brumae 仅表达Ⅰ型分枝菌酸，Mycobacterium bovis BCG 表达Ⅰ型和Ⅳ型，Mycobacterium fortuitum 表达Ⅰ型和Ⅴ型，而 Mycobacterium abscessus 表达Ⅰ型和Ⅱ型分枝菌酸谱型。通过分析不同分枝杆菌物种的总脂质提取物，依据其极性和分子大小进行表征。结果显示，大多数极性脂质（如 PDIMs）存在于 Mycobacterium bovis BCG 中，但在 Mycobacterium fortuitum、Mycobacterium brumae 以及 M. abscessus 的光滑形态型中则未检出。

分枝杆菌牛型卡介苗（mycobacterium bovis BCG）中仅存在酚类糖脂，而分枝杆菌脓肿亚种（mycobacterium abcessus）的样本中则仅检测到糖肽脂。与霉菌酸、酰基甘油以及PDIMs、PIMs类似，这些物质也可通过一维薄层色谱（TLC）或二维薄层色谱（2D TLC）分析轻松可视化。在一维薄层色谱中，使用了两种类型的染色剂以显示PIMs。

进行本方案时最重要的是在整个操作过程中不要使用任何塑料仪器。