利用冷冻电子显微镜和迭代螺旋实空间重构解析HIV-1衣壳组装体的结构

本实验的总体目标是提供一种利用冷冻电子显微镜获取螺旋组装分子三维结构的方法。该方案首先采用快速稀释与背面 blotting 方法进行冷冻电镜样品制备，在制备冷冻水合电镜载网时 transiently 降低盐浓度。该过程可在保证蛋白质稳定性的同时降低背景噪声，并在随后的冷冻电镜低剂量数据采集过程中提高信噪比。

衍射图样的螺旋索引已完成。随后进行图像处理，接着进行实空间三维重构，最终得到HIV衣壳或ca管的密度图。通常，初次接触该方法的人员会遇到困难，因为在最佳数据采集与分析过程中存在多个关键步骤。

例如，在 HIV 的情况下，一种衣壳管状组装结构仅在摩尔浓度的源溶液中形成，通过快速降低盐浓度而不影响其结构。获得高质量的冷冻电镜图像至关重要。给定一幅管状结构图像，很难了解应如何对关键的管状结构进行指标标定，以及可以考虑使用哪种软件进行三维重构。

本视频提供了一种详细且简便的方法，用于获取物理物体的三维重建图像，可作为您实验的参考。我将与 Dr.Puja 一起演示该操作流程。我们两人均来自 Dr.Laboratory。为准备用于冷冻电镜的 HIV-1 衣壳蛋白组装体，首先在 25 毫安电流下对 200 目铜网的碳膜面进行 25 秒的辉光放电处理。

使用雾化器将环境室内的湿度调节至80%，该环境室为自制的手动重力驱动冷冻装置。同时，用液氮冷却玻璃瓶中的液态乙烷，并将浸入式冷冻装置安装到手动重力驱动装置上。接着，使用镊子将夹钳夹紧在载网边缘。

将2.5 µL预组装的蛋白溶液滴加到载网的碳膜面。然后将镊子装载到打孔器的推杆上，使载网的碳膜面背离方向。向载网背面加入3 µL低盐稀释缓冲液。

立即用一张滤纸在同一侧吸去载网上的液体。保持载网整个背面与滤纸紧密接触约六秒钟。移去滤纸后，立即将载网浸入液态乙烷中。

最后，从柱塞上取下镊子，并迅速将载网转移至载网储存盒中。通过将冷冻水合载网装入FEI Polar G2电子显微镜，开始冷冻电子显微镜观察。该显微镜工作电压为200千伏，配备Gatan 4K × 4K CCD相机。

在低剂量搜索模式下，增加约 200 倍的放大倍数。对整个载网进行筛查，寻找具有合适冰层的区域。将这些区域的位置保存到载台文件中。

调用已保存的位置，并进一步筛选这些区域。在低剂量搜索模式下，使用 3,900 倍的放大倍数。选择具有均匀薄层冰的区域用于数据采集，这些区域的特征是孔洞上方悬浮有长管状结构。

将所有区域保存至第二阶段文件中。切换至曝光模式。设置59,000倍的放大倍数，并插入直径为100微米的物镜光阑。

然后调节物镜散光和电子束强度，使剂量约为每次曝光每平方埃15个电子。返回低剂量搜索模式，并移动到已保存的位置。识别并居中一根良好的微管。

使用CCD相机切换至对焦模式，调节焦距并设置通常在0.5至2.5微米之间的欠焦值。然后切换至曝光模式，设置曝光时间为0.3至0.5秒，以获得每平方埃15个电子的剂量。在胶片相机上采集图像，曝光前让胶片稳定10秒钟。

采集完图像后，移动到下一个已保存的位置，并重复此过程以采集更多图像。使用全浓度的 D 19 显影液显影胶片，持续 12 分钟。然后使用尼康 Super cool scan 9,000 ED 扫描仪以 6.35 微米的像素尺寸对图像进行数字化。

螺旋结构可通过两个参数进行表征：贝塞尔阶数 N 和螺旋表面晶格在傅里叶变换中的层线编号 L。每条层线由 N 和 L 描述，并对应于表面晶格上一组以 H 和 K 指数标记的线条。

开始螺旋索引时，使用 Iman 的程序 Helix boxer 选取一段相对较长且笔直、直径均匀的管状结构，并将图像以 MRC 格式保存。随后使用 Iman 的程序 boxer 测量该管状结构的半径。利用基于互相关的方法（例如 MRC 软件包中的 I-M-G-C-C-F）确定 HEL 重复距离。

然后计算前庭。使用等于重复距离整数倍的新盒长进行变换。接下来，选择两条主层线，以定义两个基本的表面晶格矢量，分别为“一零”和“零一”，单位为FFT像素。

确定傅里叶变换中两条主层线的层线序号以及最大振幅对应的半径。根据两条主层线的层线序号及其对应的贝塞尔函数阶数，利用书面实验方案中所述的选择定则，可求得亚基之间的旋转角度以及单星螺旋的轴向升距。这两个实数描述了管状结构的螺旋对称性。

3D 重建始于使用 Iman 程序 Boxer 进行颗粒分割。打开包含螺旋颗粒的显微照片后，在 Boxer 的控制面板中将一个颗粒切割成重叠的片段。选择螺旋模式并设置选框参数。

盒子的尺寸应大于颗粒的直径，OLA 的值应约为盒子尺寸的 90%。向左点击后，点击颗粒框任一端将自动沿螺旋长度生成一系列颗粒框，并保存框选的片段及其坐标。下一步是使用迭代螺旋实空间重构方法（I-H-R-S-R）进行初始三维重构，然后再进行 I-H-R-S-R 处理。

反转冷冻电镜图像的对比度并应用低通滤波。然后通过输入 generator 命令打开 I-H-R-S-R 程序的图形界面。在图形界面中提供所有关于 boxed particles 堆栈的信息，包括堆栈的名称和路径、堆栈中的图像数量以及对称性参数的数值。

单击完成按钮以创建重建脚本。B 25 SP。我使用实心或空心圆柱体作为初始参考，并让程序循环运行，直到定义的螺旋对称性不再发生变化，这通常在几次循环后发生。正确的螺旋对称性应能获得稳定收敛的重建结果。

上一轮循环中生成的重构结果将用作进一步优化的初始参考。最后，以I-H-R-S-R生成的三维密度图作为初始参考，进行迭代优化的三维重构，以实现进一步优化。螺旋对称性固定为由I-H-R-S-R程序确定的亚基间的旋转角度和轴向上升距离。

接下来，使用 CTF find 3 和 CTF tilt 程序（采用称为 FT 和 mu 的 spider 程序）确定显微照片中存在的离焦和像散。通过 CTF 将粒子片段乘以对比度传递函数（简称 CTF），并对 CTF 校正后的图像与参考体积的投影进行投影匹配，采用多参考比对方法。非平面倾斜角度的变化范围限制在正负 10 度以内，并以 1 度为步长进行采样，引入诸如平面内角度接近 0 度或 180 度时具有高相关系数、X 方向位移受限等约束条件。

对于每个片段的比对参数，仅将满足约束条件的片段纳入重构。每次迭代优化循环结束后，使用反投影生成一个三维重构，并通过除以CTF的平方，施加螺旋对称性，以生成具有对称性的体积。当新的三维重构分辨率不再进一步提升时，迭代优化过程终止。

选取一个 HIV 单个衣壳组装结构，即一个 92 e 管状结构，对其进行裁剪，并计算其傅里叶变换，用于螺旋索引分析两个半径：确定第一零层线和零一层线最大振幅对应的半径。随后计算得到第一零层线和零一层线的终值分别为 -12 和 11，重复距离为 5195.48 埃。该管状结构的螺旋对称性确定为 ΔZ = 6.81 埃，Δφ = 328.88 度；通过 I-H-R-S-R 方法将 ΔZ 和 Δφ 精修至 7.13 埃和 328.86 度，并在经过 10 轮迭代循环后生成了初步的重构结构。

经过迭代优化后的最终重构结果，相较于使用 I-H-R-S-R 方法计算得到的初始模型，显著改善了密度图的质量。衣壳组装管的密度图以三个正交切片形式展示，分别平行于管轴且靠近表面、垂直于管轴，以及平行并通过管轴。所展示的结构是基于三维密度图在1.8 Sigma等值面（包含100%体积）进行表面渲染所得的结果。

观看本视频后，您应能很好地理解如何利用冷冻电子显微镜获得自组装分子的三维结构。