基于V3区群体测序进行HIV-1嗜性基因型推断

本实验的总体目标是通过测序HIV病毒包膜基因的V3区，推断HIV感染患者的病毒嗜性，首先从患者血浆中提取HIV RNA。接着，使用巢式RT-PCR扩增HIV gp120的V3区。然后通过凝胶电泳检测扩增产物的存在，随后对扩增的V3区产物进行基于群体的测序分析。

最后，使用碱基识别软件分析序列，并利用基因组到表型（genome to pheno）算法推断共受体使用情况。最终，通过基于群体的HIV V3环测序，这些结果可以显示患者体内的病毒群是否为R5型或非R5型。因此，该技术相较于现有的表型细胞实验等方法的主要优势在于，它可在任何配备测序设备的实验室中进行，成本更低、耗时更短，且所需起始材料更少。

该技术与抗逆转录病毒治疗相关，因为它可以判断患者的病毒群体是否可能对CCR5拮抗剂产生应答。从500 µL血浆中，使用Easy Mag自动提取仪提取HIV RNA。随后转移至PCR洁净室进行RT-PCR反应体系的建立，以确保对病毒群体进行充分取样。

本一步法反应中，每个逆转录反应均需设置三个重复。使用病毒RNA合成cDNA，并利用SQV three F1和CO 6 0 2 prime repair特异性扩增HIVV的three区域。各组分用量基于每个反应进行计算。

使用重复移液器配制足够用于待扩增样本数量的储存混合液。将36 µL样本混合液加入PCR板的每个孔中。随后切换为多通道移液器，将微升级的RNA样本提取物转移至指定的各个孔中。每次加样时务必更换吸头。

转移完成后，用PCR条形管盖封闭各孔。然后将PCR板放入已编程的热循环仪中，对HIVV三区进行一步法反转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）。对于巢式PCR，使用SQV三F二和CD四R引物对。

根据待扩增的样本数量，计算在PCR洁净室中所需的试剂用量。配制巢式PCR反应混合液，然后使用多通道移液器将19微升分装至洁净PCR板的每个孔中。完成逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）后，转移至扩增后操作区。

使用八通道多通道移液器将一微升 R-T-P-C-R 模板转移至巢式 PCR 反应体系中。每次加样后均需更换吸头。用 PCR 排管盖密封各孔，并将反应板转移至热循环仪中进行扩增。

当温度降至25摄氏度后，从热循环仪中取出反应板。为确认V3区已成功扩增，首先通过凝胶电泳分析扩增产物。使用Cyber Safe染料制备1.6%琼脂糖凝胶。

使用10微升多通道移液器，将8微升PCR样品转移至相应的孔中。同时，每行至少在一个孔中加入DNA分子量标记物。

以约 100 伏电压电泳运行 10 分钟。通过紫外荧光观察条带，并拍照记录图像。记录所有三个重复扩增均成功的样品。

如有必要，对扩增产物少于三次的样品重复进行逆转录-聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）。扩增的病毒cDNA样品将使用V 3 0 2 F和S QV three R one引物通过DNA测序反应进一步验证。从冷冻柜中取出大包装二试剂，在室温下解冻。

根据待测样本数量计算并配制所需的试剂。使用多通道移液器将5 µL测序反应混合液分装至相应的孔板孔中。用Kimwipe纸覆盖孔板，置于一旁备用。

同时，通过向剩余的PCR扩增产物中加入180微升无菌水，制备1:15的稀释液。取1微升稀释后的样品，用移液器将其加入相应孔板的底部。每次转移样品后，均须更换新的吸头。

用八联管盖密封反应板，涡旋振荡1秒。离心反应板时，将转速设为1405 ×g。当转速达到1405 ×g时，停止离心。

将培养板放入热循环仪中以进行反应。在每个孔中加入4微升3摩尔的醋酸钠和40微升预冷的95%乙醇，使DNA沉淀，重新密封盖子。离心培养板10秒，并轻敲培养板以去除任何气泡。

将培养板置于 -20 摄氏度下 30 分钟至 2 小时。在 2000 ×g 条件下离心 20 分钟以回收 DNA。移除并弃去条状盖。

将培养皿倒置在废液容器上方，倾倒出上清液。通过将倒置的培养皿在纸巾上轻压，去除残留的上清液。

将两张纸巾对折，包裹住培养皿。将培养皿倒扣放入离心机中，以 140 5G 离心，当转速达到 140 5G 时停止离心。

然后用155微升95%乙醇洗涤并倾去。随后重复离心步骤。让酶标板静置2至5分钟，以使残留的乙醇完全挥发。

为了使 DNA 样本变性，使用多通道移液器将 10 微升高染料加入板上的所有孔中，包括空孔。用封膜密封反应板，并置于 90 摄氏度的热循环仪中孵育 2 分钟。最后，将样本板放入测序板中，并送入测序仪进行测序。

一种可行的数据分析途径是使用软件 Recall 进行自动碱基识别，无需人工干预。Recall 是一款免费的基于自定义的碱基识别软件，登录后选择“浏览”选项以上传样本文件。找到原始测序数据文件，并上传最多 20 兆字节的数据。

接下来，将参考序列设置为 V3。点击处理数据。在页面右侧选择生成的文件夹以显示样本列表。

红色表示未通过，绿色表示已通过。点击特定样本并点击“查看”按钮后，您可查看序列，按照页面右侧的说明浏览序列，并将文件下载到一个压缩文件夹中。

可通过基于群体测序生成的序列，利用基因型到表型的共受体算法推断病毒嗜性。在显著性设置的下拉菜单中，选择基于 MOTIVATE 临床数据分析得出的优化选项，对应 2% 和 5.75% 的假阳性率（FPR）。现在请选择上传或粘贴待分析序列。

可接受 FASTA 文件格式。请勿添加其他内容，以获取用于预测对 CCR5 拮抗剂应答性的基因型 Tono FPRA。生成的 G2P 报告将提供 V3 环的氨基酸序列，并标示与非 R5 嗜性病毒相关的突变位点。

在报告底部给出了假阳性率，并以对 CCR5 拮抗剂的应答情况对其进行解释。该报告可下载为 PDF 文件。如果某个样本的三个序列中任意一个被推断为非 R5 型，则该患者不太可能对 CCR5 拮抗剂产生预期的应答。HIV-1 V3 环的 RT-PCR 扩增产物进行凝胶电泳的结果表明，并非所有临床样本都能扩增出产物。

通过召回读取，可以以色谱图形式显示扩增样品产生的序列。预期结果为混合信号较少的清晰序列。偶尔序列可能杂乱，难以进行准确的碱基判定。

一些患者可能被鉴定为携带非 CCR5 利用型病毒，如上图所示。这些患者不太可能对 CCR5 拮抗剂治疗产生应答。然而，大多数患者被发现其病毒群体由 CCR5 利用型病毒组成，G2P 分析报告底部的绿色框即指示了这一点。

因此，一旦掌握该技术，从开始到结束（从提取到分析）大约可在四天内完成。观看本视频后，您应能充分理解如何结合基于群体的测序方法与基因组表型生物信息学算法来预测病毒嗜性。

好了，就到这里。感谢观看，祝您的实验顺利成功。