Annexin V 结合实验：一种基于荧光标记磷脂酰丝氨酸检测凋亡红细胞的荧光技术

在某些病理条件下，红细胞会发生细胞皱缩，同时细胞膜磷脂——磷脂酰丝氨酸——从膜内层易位至外层，从而引发程序性细胞死亡（即红细胞凋亡），并触发巨噬细胞介导的细胞吞噬作用。

测量离子载体诱导的分离人红细胞群体的红细胞程序性死亡 通过 Annexin V 结合实验，从悬浮于无葡萄糖缓冲液中的红细胞开始。

葡萄糖耗竭会诱导细胞应激，激活胞质蛋白激酶C，进而激活钙离子通道，导致钙离子内流。此外，钾离子通道也被激活，引起钾离子外流和细胞皱缩。

接下来，加入钙离子载体，该载体可与细胞外钙离子形成稳定的复合物。该复合物促进钙离子跨细胞膜进入胞质溶胶，进一步提高细胞内钙离子浓度。这继而激活翻转酶——一种双向磷脂转运蛋白——有助于磷脂酰丝氨酸从细胞膜内层向外层的转位，降低膜的不对称性，从而诱导红细胞凋亡（eryptosis）。

离心经离子载体处理的红细胞。用含钙的结合缓冲液重悬细胞。加入荧光染料偶联的膜联蛋白V溶液。

钙依赖性磷脂结合蛋白Annexin V具有高亲和力结合外层细胞膜上暴露的磷脂酰丝氨酸残基的特性。

利用荧光激活细胞分选技术，根据Annexin V的荧光强度对红细胞群体进行分离。与健康红细胞相比，凋亡红细胞表现出更高的Annexin V荧光强度。

取2毫升5X Annexin V结合缓冲液，加入8毫升PBS，稀释成1X结合缓冲液。将经离子霉素处理和未处理的细胞沉淀分别重悬于1毫升1X结合缓冲液中。

取235微升结合缓冲液中的细胞悬液，加入到微量离心管中，再加入15微升Annexin V-Alexa Fluor 488偶联物。将细胞在室温下避光孵育20分钟。

在室温下以 700 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。用 1× 结合缓冲液洗涤细胞两次：将细胞沉淀重悬于 1.5 毫升结合缓冲液中，然后在室温下以 700 × g 离心 5 分钟。

弃去上清液，将细胞沉淀重悬于250微升1×结合缓冲液中，用于流式细胞术检测。随后，取200微升经Annexin V染色的红细胞转移至适用于流式细胞术的1毫升圆底聚苯乙烯管中。

登录流式细胞仪软件，点击“新建实验”按钮。点击“新建样本管”按钮，选择“全局表”，然后选择“应用分析”，以488纳米激发波长和530纳米发射波长测量荧光强度。

设定收集用于荧光激活细胞分选分析的细胞数量为 20,000。选择目标试管，然后点击 “Load” 按钮。点击 “Record” 按钮以获取前向散射和侧向散射的测量数据。对所有样品重复此操作。

右键单击 “Specimen” 按钮，然后单击 “Apply Batch Analysis” 以生成结果文件。再次右键单击 “Specimen” 按钮，然后单击 “Generate FSC Files”。