固定细胞吞噬凋亡细胞实验：一种利用荧光显微镜研究巨噬细胞对凋亡细胞吞噬作用的方法

发生凋亡（程序性细胞死亡）的细胞会在其细胞表面展示“吃我”信号，从而促进被吞噬细胞（一类特殊的免疫细胞）识别并降解。这种清除凋亡细胞的过程称为胞葬作用（efferocytosis）。

进行胞葬作用检测时，首先取双标记的凋亡细胞悬液。这些细胞的表面用生物素标记，胞质则用细胞示踪染料标记，以标记凋亡细胞来源的物质。

将细胞悬液加入贴壁的巨噬细胞培养物中，这些巨噬细胞作为效应细胞发挥作用。离心以促使巨噬细胞与凋亡细胞接触，然后进行孵育。

巨噬细胞上的胞葬受体可结合凋亡细胞膜上的磷脂酰丝氨酸——一种“吃我”信号，从而促进凋亡细胞的吞噬。凋亡细胞的小片段被摄入由膜包被的囊泡内，这种囊泡称为胞葬体（efferosome）。

这会产生一个被吞噬清除的部分——即凋亡细胞内部位于巨噬细胞内的部分——以及一个未被吞噬清除的部分——即未被内化的凋亡细胞部分。

加入荧光标记的链霉亲和素，其可结合未发生胞葬作用组分表面暴露的生物素分子，从而区分凋亡细胞中未被内化和已被内化的部分。

在荧光显微镜下，未被内化的凋亡细胞部分显示链霉亲和素标记，而效应小体则呈现为无链霉亲和素的独立小点。

为了定量分析胞葬作用，需确定离散的胞葬小体数量，并测量被胞葬和未被胞葬的凋亡细胞组分的荧光强度。

在制备人巨噬细胞和凋亡的Jurkat细胞后，使用血细胞计数板对凋亡细胞进行计数。然后，将足够数量的凋亡细胞转移至1.5毫升微量离心管中。

离心收集Jurkat细胞 通过 500 × 离心 g 5 分钟后，将细胞重悬于 500 微升 PBS 中。在 Jurkat 细胞离心的同时，取 10 微升 DMSO 加入新的微量离心管中。

接下来，将少量 NHS-生物素溶解于 DMSO 中。然后，取 500 微升凋亡细胞与 PBS 悬液，转移至含有 DMSO 和 NHS-生物素的离心管中。随后，根据生产商说明书稀释适量的细胞示踪染料。

将细胞悬液在室温下避光孵育20分钟。然后加入等体积含10%胎牛血清（FBS）的RPMI 1640培养基，再于室温下避光孵育5分钟。

此后，离心收集细胞 通过 500 × 离心 g 5分钟。然后弃去上清液，将染色的细胞重悬于100微升含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基中。将100微升染色细胞悬液逐滴加入每孔巨噬细胞中。随后，以200 × g离心培养板 g 1 分钟。将培养板置于 37 摄氏度、5% CO₂ 条件下孵育₂ 在组织培养孵育箱中。

在适当的孵育时间后，从培养箱中取出细胞。随后用1毫升PBS洗涤细胞两次。之后，向每个孔中加入稀释的FITC标记的链霉亲和素，并在避光条件下孵育20分钟。

用 1 毫升 PBS 洗涤细胞三次，每次冲洗后在室温下轻轻振荡样品 5 分钟。然后在室温下用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。用 PBS 冲洗细胞一次，以去除多余的多聚甲醛。

将盖玻片固定在成像载玻片上，并将载玻片转移至荧光显微镜。采集足够数量细胞的z轴层扫图像用于定量分析。