评估功能性SARS-CoV-2中和抗体

从含有不同浓度抗严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）中和抗体的系列稀释人血清开始。

引入含有荧光素酶RNA、整合酶和逆转录酶的假病毒，该假病毒被包裹在含有SARS-CoV-2刺突蛋白的脂质双层中。

抗体对病毒的中和作用取决于血清稀释度，较低的稀释度表现出最强的中和效果。

引入表达血管紧张素转换酶2受体（ACE2受体）或跨膜丝氨酸蛋白酶2（TMPRSS2）的靶细胞。

在较高血清稀释度下，非中和病毒与ACE2受体相互作用，同时TMPRSS2切割刺突蛋白，从而促进病毒融合。

进入细胞后，荧光素酶RNA被逆转录为DNA，该DNA整合到宿主基因组中并表达产生荧光素酶蛋白。

用含有荧光素酶底物和裂解剂的检测缓冲液替换培养基。

细胞裂解，释放出胞内荧光素酶，后者与底物相互作用并产生强发光信号。

通过测定血清稀释液中的发光量来确定病毒中和百分比——达到50%中和效果的稀释度即为中和滴度。

首先，向白色96孔板的B至H行、第1至12列各孔中加入50 µL含10% FBS和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。

在A行2至10列的孔中加入5微升恢复期血清，总体积为100微升含10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的DMEM培养基。在A11和A12孔中分别加入5微升阳性与阴性抗血清作为对照。

从A行各孔中移除50微升溶液，并对下方所有孔进行两倍系列稀释。每次稀释时，使用多通道移液器通过反复吹打5-10次混匀溶液，注意不要产生气泡。

完成连续稀释后，弃去每列最后一孔中的最后50微升液体。

将板在500转/分钟下离心1分钟，以确保孔壁上无残留液体。根据文本稿件中的描述，计算稀释SARS-CoV-2假病毒所需的DMEM用量。

在移液器槽中混合稀释后的PV溶液，并将50 µL分装至各孔中，A6至A12孔除外，这些孔为仅含细胞的对照孔。A1至A6孔作为仅含PV的对照。

将板在500转/分钟下离心1分钟，以确保孔壁上无残留病毒。然后，在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育板1小时，使血清与SARS-CoV-2糖蛋白结合。

接下来，准备一块24小时前已转染ACE2和TMPRSS2质粒的HEK 293T/17靶细胞培养板。移除培养板中的培养基，用2毫升PBS洗涤两次，加入PBS时应沿培养皿一侧缓慢加入，以避免细胞脱落。

弃去 PBS，向培养皿中加入 2 毫升胰蛋白酶。将培养皿放入培养箱中，直至细胞脱落。

细胞脱落后，向培养板中加入 6 毫升含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM 培养基以终止胰蛋白酶活性，并轻柔重悬细胞。

使用自动细胞计数器或计数板对细胞进行计数。将 1 × 10⁴ 个细胞分装至总体积为 50 微升的溶液中，加入每孔，然后将培养板置于 37 °C、5% 二氧化碳条件下孵育 48 至 72 小时。

孵育后，吸去所有孔中的培养基，每孔加入25微升PBS与商用荧光素酶检测试剂按1:1比例配制的混合液。使用配备微孔板发光仪的商用荧光素酶检测系统读取结果。

根据光度计生成的原始数据，按照文稿中的描述计算中和抗体的IC50滴度。