利用高通量荧光成像检测SARS-CoV-2中和抗体的假病毒侵染

该方法为回答有关正在研发的严重急性呼吸综合征冠状病毒2疫苗的一个更为重要的问题提供了途径：该疫苗能否诱导产生中和抗体反应？该技术的主要优势在于，其可在生物安全二级实验室中进行。此外，该方法相对快速且成本较低，非常适合同时分析大量样本。

演示中和酸操作步骤的是实验室高级技术员 Ricardo Marius 和医学博士生 Taylor Jamieson。

首先在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中，于37°C及5%二氧化碳条件下培养Vero E6细胞。

传代细胞时，首先加入10毫升PBS，轻轻晃动培养皿4到5次以洗涤细胞。吸除PBS后，加入3毫升胰蛋白酶EDTA，晃动培养皿确保整个表面被覆盖，然后在37°C条件下孵育。待细胞脱落之后，加入7毫升含10% FBS的DMEM培养基以终止胰蛋白酶作用，再通过反复吹打数次重悬细胞。

通过离心去除胰蛋白酶，并在不扰动细胞沉淀的情况下吸除上清液，然后将细胞重悬于10毫升新鲜DMEM中。计数后，每块15厘米培养皿中加入约1×10⁷个细胞，培养1至2天，直至细胞达到100%汇合度。

为制备用于滴定的VSV spike EGFP假病毒，用无血清DMEM将病毒原液稀释后，以0.01的感染复数感染细胞，病毒稀释液体积为12毫升。

加入病毒后，将细胞在37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时，期间偶尔轻轻摇动。孵育结束后，弃去接种液，更换为新鲜DMEM培养基（添加2%胎牛血清和20毫摩尔HEPES），然后将细胞在34摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育24小时。次日，使用荧光显微镜观察感染细胞中EGFP的表达情况。

当观察到明显的细胞病变效应和细胞脱落时，收集培养上清液，并通过离心去除碎片。为避免多次冻融，应在-80摄氏度保存前将上清液分装。

为测定病毒滴度，将Vero E6细胞以每孔6 × 10⁵个细胞的接种密度接种于6孔板中，孵育过夜。次日，通过向7个微量离心管中各加入900 µL培养基，然后向第一管中加入100 µL病毒原液，制备10倍系列稀释的病毒液。短暂涡旋混匀后，从第一管取100 µL稀释病毒液加入下一管，每转移一次均需涡旋混匀。随后，将Vero E6细胞培养板每孔中的上清液更换为500 µL的10⁻²至10⁻⁷梯度稀释的病毒液。

在细胞培养箱中孵育45分钟，期间每15分钟轻轻摇动一次，随后将接种物替换为覆盖液，并将细胞在34摄氏度、5%二氧化碳条件下继续孵育48小时。孵育结束后，为通过结晶紫染色观察噬斑，先用PBS洗涤细胞一次，然后向每孔加入2毫升0.1%结晶紫溶液。将培养板置于摇床上，室温下摇动约20分钟，随后每孔用PBS轻轻洗涤两次。

最后一次洗涤后，将培养板静置风干至少一小时，然后按照所示公式计算每孔病毒滴度，单位为每毫升空斑形成单位。进行中和试验时，使用多通道移液器将 Vero E6 细胞以每毫升 2 × 10⁵ 个细胞的密度接种至 96 孔板，每孔加入 100 µL，于 37°C 及 5% CO₂ 条件下孵育 24 小时。次日，将待测患者血清样本置于 56°C 水浴中加热灭活 30 分钟。

然后，在一个空的96孔组织培养板中，通过将8微升血清加入A行各孔中含抗生素的72微升无血清DMEM中，制备患者血清样本的10倍系列稀释液。随后，向B至G行的每孔中加入40微升无血清DMEM，向H行每孔中加入80微升。使用12通道多通道移液器混匀A行中的样本，然后将A行每孔中的40微升样本转移至B行对应孔中。混匀后，依次对后续各孔行进行相同稀释操作，直至F行。接下来，向A至G行每孔中加入40微升VSV spike EGFP病毒液（感染复数为0.05），通过上下吹打4至5次混匀，随后将培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时。孵育结束后，小心吸去Vero E6细胞培养板各孔中的上清液，将样本稀释板中每孔的60微升抗体-病毒混合液转移至细胞培养板的对应孔中。所有样本转移完成后，将细胞培养板置于37摄氏度、5%二氧化碳条件下孵育1小时，每隔20分钟轻轻摇动一次。

孵育完成后，向细胞培养板的每个孔中加入140微升羧甲基纤维素覆盖液，将培养板转移至34摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中。24小时后，使用自动化荧光成像仪在488纳米波长下对培养板进行成像，并利用成像仪的自动计数功能定量单个EGFP焦点。

在此代表性示例中，使用一种 commercially available 的针对 SARS-冠状病毒-2 刺突蛋白受体结合域的中和抗体作为阳性对照，同时以 IgG 作为阴性对照。

根据荧光成像检测到的EGFP焦点数量计算抑制率。利用感染SARS冠状病毒2约三个月后采集的康复期患者样本进行的假病毒中和实验显示，住院患者的中和能力较无需住院的患者更强。该方法还可用于评估其他旨在阻断病毒感染的COVID-19预防和治疗药物。