使用磁性激活细胞分选法纯化CD31⁺内皮前体细胞

取内皮祖细胞（EPCs）的贴壁培养物，即脑微血管内皮细胞的前体细胞。

通过诱导多能干细胞分化获得的培养物包含表达表面标志物CD31的内皮祖细胞（EPCs）以及混杂的CD31阴性细胞。

使用解离试剂孵育以解离细胞，并过滤获得单细胞悬液。

加入培养基以中和酶，离心去除上清液，并将细胞重悬于缓冲液中。

使用封闭试剂孵育，以抑制细胞的 Fc 受体，防止非特异性标记。

加入针对CD31的荧光素偶联抗体并孵育，以标记EPCs。

离心并弃去未结合的抗体。与含有可结合荧光染料的一种抗体的抗体复合物共同孵育。

加入聚合物包被的磁性纳米颗粒并进行孵育，使纳米颗粒与复合物的第二抗体结合。

利用磁场分离与纳米颗粒结合的细胞。

弃去未标记的CD31阴性细胞悬液，将纯化的细胞重悬于培养基中。CD31阳性内皮祖细胞即可用于后续实验。

内皮祖细胞培养的第5天，吸去孔中的培养基，每孔加入1毫升消化试剂。将培养板置于37摄氏度孵育6至8分钟。使用微量移液器将细胞消化并分散为单细胞，随后将细胞悬液通过40 µm细胞滤网过滤至含有10 mL DMEM/F-12培养基的50 mL离心管中。

为终止消化反应，加入 DMEM/F-12/10 培养基至 50 毫升刻度线。充分吹打混匀，并保留 10 微升用于细胞计数。将 50 毫升离心管在 20 至 25 摄氏度下以 200 g 离心 5 分钟，使细胞沉淀。离心后，吸除上清液，并用 10 毫升 DMEM/F-12/10 培养基重悬细胞沉淀。

将细胞悬液转移至新的15毫升离心管中。在20至25摄氏度下，以200 g 离心5分钟，再次沉淀细胞。然后，将细胞沉淀重悬于流式缓冲液1中。接着，按1比100的比例加入FcR阻断试剂，孵育5分钟。随后，加入按1比200稀释的异硫氰酸荧光素（FITC）标记的CD31抗体。

将悬液在20至25摄氏度避光条件下孵育30分钟。孵育结束后，向样品中加入10毫升流式缓冲液1，并保留10微升悬液用于流式细胞术分析，以确定CD31阳性细胞的比例。在20至25摄氏度下，以200 g 离心5分钟。离心后，用流式缓冲液1溶液重悬细胞。

接下来，每100微升细胞悬液中加入5微升FITC筛选混合液。用移液器充分混匀，并在20至25摄氏度避光孵育15分钟。随后，每100微升细胞悬液中加入5微升磁性纳米颗粒。充分吹打混匀，于20至25摄氏度避光孵育10分钟。

将细胞悬液转移至一个5毫升流式细胞管中，并加入流式缓冲液1，使总体积达到2.5毫升。随后，将流式细胞管放入磁铁中静置5分钟。连续操作，将磁铁和管子倒置，倾倒出含有FITC-CD31抗体未标记细胞的细胞悬液。保持磁铁和管子倒置状态2至3秒，然后移除剩余液体。

将离心管放回直立位置前，吸除管壁上的任何液滴。从磁铁上取下流式细胞管，加入 2.5 毫升流式缓冲液 1，以洗涤残留的 CD31 阳性细胞。轻柔吹打细胞 2 至 3 次，使其重悬。然后，将流式管放入磁铁中静置 5 分钟。

至少重复洗涤四次，以去除试管中未标记的 FITC-CD31 细胞。将流式管从磁铁上取下，用适量适宜的培养基重悬纯化的 CD31 阳性细胞。保留两份 1 微升的细胞悬液，一份用于细胞计数，另一份用于流式细胞术分析，以评估磁性激活细胞分选后 CD31 阳性细胞的纯度。