磁激活细胞分选：分离c-Kit阳性细胞的方法

- c-Kit，或 CD117，是一种由存在于骨髓和血液中的造血干细胞或祖细胞表达的酪氨酸激酶跨膜受体。它也是检测急性髓系白血病的标志物。

为了分离 c-Kit 阳性细胞，取小鼠后肢骨骼并压碎以释放骨髓。过滤骨髓悬液以去除骨碎片。将含有骨髓细胞的滤液叠加于密度梯度介质上，离心以分离单核细胞与其他组分。

将含有与抗-CD117小鼠抗体偶联的微珠的试管收集单核细胞的浑浊层。孵育，使抗体-微珠复合物与c-Kit阳性细胞上的CD117受体结合。将孵育后的悬液通过置于磁场中的磁性柱。所有被磁性微珠标记的c-Kit阳性细胞保留在柱中，而未标记的细胞则流过。

将柱子移出磁场，并使用适当的缓冲液冲洗柱内容物，以洗脱 c-Kit 阳性细胞。在以下实验方案中，我们将展示如何从转基因小鼠的骨髓中分离 c-Kit 阳性细胞。

— 首先，从安乐死的小鼠中取出腿部骨骼。用手术刀清除骨骼上的组织。然后，将骨骼置于冰上预冷的磷酸盐缓冲液（PBS）中，并用研杵捣碎骨骼。接着，使用10毫升移液管将细胞悬液通过70微米细胞滤筛过滤至50毫升螺口离心管中。用预冷的PBS多次冲洗研钵和研杵，并将冲洗液一并加入50毫升离心管中。

接下来，离心骨髓并用真空泵和玻璃移液管吸除上清液。用5毫升PBS重悬细胞沉淀。使用移液器，将悬浮的骨髓缓慢加至室温多蔗糖溶液的顶部。

此后，将多蔗糖溶液在400 ×g 条件下离心20分钟，离心时关闭刹车。离心结束后，用移液器收集浑浊的总单个核细胞界面，并转移至新的15毫升离心管中。用PBS将体积调至10毫升，并取出20 µL用于细胞计数。

离心后，弃去上清液，将沉淀置于冰上。接下来，用含EDTA和BSA的PBS重悬细胞沉淀。向细胞悬液中加入CD117磁珠，并涡旋混匀。随后，在4摄氏度下孵育10分钟。然后，用更多含EDTA和BSA的PBS将体积补至10毫升，并在4摄氏度下以1,200 ×g离心5分钟。

使用真空装置吸除上清液，并将细胞沉淀重悬于含EDTA和BSA的PBS中。然后，向置于磁力架上的磁性柱中加入3 mL含EDTA和BSA的PBS，使其流入收集管中。待缓冲液完全流经柱体后，加入细胞悬液，使其流经磁性柱并进入收集管。

接着，向柱中加入 5 毫升含 EDTA 和 BSA 的 PBS，并立即用活塞冲洗。取出活塞，重复冲洗操作，然后进行细胞计数。离心细胞后，弃去上清液，将细胞沉淀重悬于完全 IMDM 培养基中进行培养。将细胞在 37 摄氏度、5% 二氧化碳条件下培养过夜。