在多电极阵列上分离与培养鸡胚神经元

取一枚含有早期胚胎的受精鸡卵。

对蛋壳进行灭菌并小心打开。

取出胚胎。解剖并将头部转移到含有缓冲液的培养皿中。移除眼球。

进行切口并去除皮肤层，暴露前脑和中脑。

去除内层膜结构和血管。用缓冲液解剖并转移前脑至培养板。

将组织切成较小的碎片，并转移至锥形管中。待碎片沉降后，吸除缓冲液。

加入蛋白酶溶液。孵育以消化组织的细胞外基质并解离神经元。

移除富含酶的培养基，用神经基础培养基洗涤，去除任何残留的酶。

加入神经基础培养基。通过机械法解离组织以获得神经元悬液。

将这些神经元接种于包被有细胞外基质的多电极阵列系统上，加入神经基础培养基并进行培养。

神经元附着并延伸突起，形成神经元网络。

在神经元铺板当天，从 -20 摄氏度冰箱中取出一管细胞外基质。用 70% 乙醇喷洒后置于冰上。务必在冰上解冻细胞外基质，切勿在室温下解冻，因为细胞外基质在高于 0 摄氏度时会发生聚合。

在 BSL-2 生物安全柜中，向 100 微升的细胞外基质分装液中加入 300 微升冷的 Neurobasal 培养基，将其稀释至 25%。然后，使用 P200 移液器将 100 微升 25% 的细胞外基质溶液加至多电极阵列的中心位置，注意避免触碰电极。立即移除 ECM，仅在表面留下一层薄膜。

覆盖多电极阵列，并将其置于组织培养孵育箱中，直至准备接种神经元。开始鸡神经元的分离：用70%乙醇对E7期鸡蛋的外壳进行表面消毒。此后务必保持无菌条件。确保所有器械均用70%乙醇灭菌，所有溶液均为无菌状态。使用解剖罩有助于操作，但如果操作迅速，解剖过程并非必须使用解剖罩。

然后，取出胚胎并切除头部，围绕眼睛周围进行剪切并取出眼球。接着，使用Dumont 5号精细镊子和弹簧剪刀在腹侧做一切口，去除外层皮肤以暴露前脑和视顶盖。小心剥离并移除脑表面的膜结构。

将前脑转移至另一含有HBS的培养皿中，用弹簧剪将其剪成约2毫米大小的小块。使用无菌移液管将前脑组织块转移至50毫升离心管中。待前脑组织块沉降至离心管底部后，尽可能吸除HBS。

接着，加入1毫升预热的0.5%胰蛋白酶-EDTA，于37摄氏度孵育15分钟。使用巴斯德移液管小心吸除胰蛋白酶，避免扰动组织块。加入1毫升神经基础培养基，使组织块沉降至底部。吸除培养基并重复洗涤一次后，加入2毫升神经基础培养基，轻轻吹打直至肉眼不可见组织块。

用神经基础培养基将重悬的细胞按1比10稀释，使用台盼蓝染色和血细胞计数板计数活细胞。计数后，将相应细胞以每平方毫米2,200个细胞的密度接种于细胞外基质包被的多电极阵列上。