微电极阵列上神经元细胞培养物对刺激反应的时程依赖性增强

本实验的总体目标是分离并连接E17小鼠神经组织，以便在微电极阵列上培养、记录和刺激神经网络。该方法有助于回答神经网络动力学研究中的关键问题，特别是与学习和记忆的基本机制相关的问题。该技术的主要优势在于，微电极阵列能够同时在多个位点进行记录，与传统的单一位点玻璃微电极记录相比，可提供更高的空间和时间分辨率。

尽管该方法可用于研究学习与记忆的网络动态，也可用于探究药物毒性或设计下一代个性化医疗的实验范式。此过程的可视化演示至关重要，因为在解剖和组织解离过程中对组织的操作仅通过阅读实验方案难以掌握。准备阵列时，使用无菌移液器吸头，向每片多电极阵列（MEA）的中央加入40至50微升解冻的层粘连蛋白，并向对照培养板中加入0.2毫升层粘连蛋白。

在生物安全柜中盖上所有MEA和对照培养皿，然后将其转移至37摄氏度培养箱中孵育1小时。1小时后，使用无菌巴斯德吸管小心吸去MEA中心多余的层粘连蛋白，并让表面自然风干后再进行细胞接种。接下来，将L-15培养基倒入四个100毫米的培养皿中，盖上盖子，放入-20摄氏度冰箱冷冻约40至60分钟，直至培养基呈冰沙状但未完全冻结。

为解剖做准备，将一个玻璃培养皿倒扣在装满冰的托盘中。现在用70%乙醇喷洒动物的下腹部。使用小型手术剪，在下腹部的皮肤和皮下脂肪处剪出一个V形切口，将切口延伸至胸腔远端末端，以暴露子宫。

用镊子小心地在胚胎之间夹起子宫。用解剖剪剪除结缔组织，直至整个子宫完全游离。然后用70%乙醇短暂冲洗子宫以去除血液，再将其放入盛有冷L-15培养基的四个培养皿之一中。

随后，使用两对尖头镊子将每个胚胎从子宫及内部的胚胎囊中分离。将游离的胚胎放入第二个盛有冷L-15培养基的培养皿中，然后将头部转移至第三个培养皿，躯体转移至第四个培养皿。在生物安全柜中，将一片经高压灭菌的滤纸置于冷藏的玻璃培养皿台上，再将一个胚胎头部放在滤纸上。

接下来，将虹膜剪的下刃尖端插入颅底，在操作过程中保持下刃紧贴颅骨内表面并远离脑组织，剪开枕骨板，然后沿顶骨板之间的中线继续向前剪切。接着，沿软骨性额骨板之间继续向前（吻侧）剪切。随后，从枕骨板中心开始，分别向左和向右的中心切口两侧做垂直切口。

随后，小心地将小刮铲插入脑腹面与颅底骨板之间，直至刮铲完全位于脑下方。然后上抬刮铲以取出脑组织。使用洁净的刮铲，先去除嗅球，再以梯形模式解剖分离额叶。

接下来，将组织转移至含有保存液的15毫升离心管中。在此步骤中，使用两把无菌手术刀片将组织切碎。然后向培养皿中的切碎组织中加入2.5毫升DNase-木瓜蛋白酶混合液。

轻轻晃动培养皿，确保所有组织均悬浮于溶液中，未贴附在皿底。随后将培养皿置于37°C培养箱中孵育15分钟。在生物安全柜中，使用无菌宽口移液管将全部培养基和组织转移至一个5 mL无菌冻存管中。

将同一移液管的管尖靠近试管底部，轻柔吹打混合液10至15次。然后向解离的细胞混合液中加入2 mL预热的DMEM 5/5培养基，盖紧离心管。轻轻颠倒混匀，于室温下以573 ×g离心5分钟。

在生物安全柜中，弃去所有上清液，注意不要破坏沉淀。随后，在离心管中加入1毫升预热的DMEM 5/5培养基，以重悬细胞。使用无菌的细口移液管，通过轻柔吹打使沉淀充分分散，直至混合液呈均匀状态。

然后将10微升细胞悬液转移至微量离心管中。在生物安全柜外，向微量离心管中的10微升细胞悬液加入10微升台盼蓝染液。随后取10微升台盼蓝细胞悬液，加入一次性血细胞计数板芯片中，用于细胞计数。

在生物安全柜中，使用无菌微量移液器将 50 微升细胞悬液转移至每个阵列以及每个对照培养皿的中央。然后将盖好的培养皿置于 37 摄氏度的培养箱中孵育 3 至 4 小时。接着，向每个 MEA 轻柔加入 1 毫升预热的 DMEM 5/5 培养基。

将培养基沿MEA内边缘逐滴小心加入，避免将细胞从阵列中心冲走。随后，在每个MEA上放置带有可透气FEP膜的盖子，再放回培养箱中。两天后，用预热的DMEM+完全更换培养基，从培养皿中吸出原有培养基即可。

将移液器的尖端轻轻贴在培养皿内壁上，加入一毫升预热的DMEM+培养基。后续换液时，从培养皿中吸出500微升培养基，再加入500微升预热的DMEM+培养基。在此过程中，每隔一天在显微镜下检查培养皿样本，观察细胞在阵列表面的覆盖情况以及是否存在细菌或真菌污染。在将培养物从培养箱中取出之前，插入温度控制器并开启系统，使前置放大器的加热底板温度升至35摄氏度。

然后将带盖的培养物放入前置放大器中，使MEA孔中的黑线与参考接地点对齐。确保前置放大器的针脚正确对位，使前置放大器顶部固定牢固，且培养物盖子仍保持盖紧状态。接下来，在软件环境中点击“开始”，以启动信号的可视化。

在主窗口中选择“Spikes”（峰电位）、“Detection”（检测）、“Automatic”（自动），将标准差值更改为负五，然后单击“Refresh”（刷新）以重置阈值。在可视化信号后，单击“Stop”（停止）、“Record”（记录）和“Play”（播放）以开始记录活动。将小鼠胚胎神经元接种于60通道MEA上，可同时通过每个电极记录神经网络中的神经元活动。

以下是训练前和训练后刺激响应期间八个电极活动的代表性点阵图。垂直的红线表示刺激时间，黑色刻度线表示动作电位。在训练前，各通道对刺激脉冲即刻产生反应。

训练后，该网络表现出更持久的活动反应，以及对刺激的即时反应。图中显示了12个训练组和10个对照组网络的平均结果，训练组网络的放电频率表现出显著改变。观看本视频后，您应能够充分理解如何从胚胎小鼠中分离并获取神经组织，并掌握如何利用微电极阵列培养、记录和刺激神经网络。