等离子体光刻表面图案化用于构建细胞网络

以下实验的总体目标是构建细胞微环境，以研究发生在微米和纳米尺度上的单个细胞及群体细胞行为相关的生物学问题。该目标首先通过设计能够引导细胞定位的模板来实现；随后，利用光刻技术将这些设计转化为图案化表面，进而通过软光刻技术制备出等离子体屏蔽模具。

最后，将这些屏蔽模具以三脚架形式排列在培养皿中，以实现对下方表面的选择性等离子体暴露，从而在每个模具下方的区域留下可被细胞识别的化学图案。由此可获得结果，显示细胞行为如何依赖于其微环境以及与邻近细胞的相互作用。该方法有助于回答有关微环境对细胞行为影响的关键问题，例如：细胞群体之间的相互作用如何影响更高层级的生物学现象？

亚细胞尺度的纳米级信号如何影响细胞迁移和分化等功能？首先，使用502胶水将一个图案载玻片固定在一组空白载玻片上。接着，用铝箔制作一个容器，其尺寸略大于载玻片堆叠体，并足够容纳30克聚二甲基硅氧烷（PDMS）。

将载玻片堆叠放入容器中，然后在载玻片堆叠上浇注聚二甲基硅氧烷（PDMS），以制备初始模具。接着将容器置于真空腔内对PDMS进行脱气处理。通过快速移开并重新堵住进气阀管口数次，使空气短暂进入腔体，从而消除PDMS中的气泡。

关闭阀门，持续脱气五分钟。然后将PDMS置于洁净通风橱中，在室温下固化一至两天。固化完成后，将PDMS从母模上剥离，形成模具。

接下来，将刚混合一分钟的六克双组分环氧树脂倒入母模中，形成一层薄层。在环氧树脂固化前，立即使用多次消泡循环对其进行脱气处理。脱气后的环氧树脂静置一小时且不受干扰后，将部分固化。

向模具中添加更多环氧树脂，无需脱气，以形成更厚的结构，便于后续步骤的操作。然后让环氧树脂固化一到两天。环氧模具固化后，将其从PDMS主模具中取出，然后用胶带缠绕环氧模具，形成一个容器。

通过将PDMS倒入环氧树脂模具中，对PDMS进行脱气，并将新模具固化一至两天，即可制备出工作模具。工作模具固化完成后，将其从环氧树脂模具上剥离，并将两者均置于培养皿中，存放在超净台内的密封塑料容器中以保持清洁。为准备用于表面图案化的模具，可用剃刀片从工作模具上切下小片，并将这些小片放入培养皿中。

用永久性标记笔在培养皿背面标出这些模具片的位置，通过在模具片周围画出轮廓，使模具片形成一个三脚架，并等待三脚架确保工作模具与培养皿表面之间实现保形接触。观察培养皿底部，通过肉眼或使用小型放大镜可见的通道来确认放置良好。将组装好的样品放入等离子腔室中。

等离子体处理结束后，移除模具和配重装置，将培养皿放入生物安全柜中，在紫外灯下照射10分钟以进行灭菌。将培养皿存放于该处，直至接种细胞。

将选定的实验细胞用其标准培养基稀释，以达到所需的汇合度。当放置到图案化的培养皿表面时，向培养皿中加入三毫升细胞悬液。将图案化培养皿置于37摄氏度、5%二氧化碳、100%湿度条件下孵育数小时至数天，使细胞在等离子体细胞所创建的图案上进行组装。

通过相差显微镜检查细胞形态。培养神经母细胞瘤细胞时，每日添加10 µM的视黄酸，直至观察到细胞分化为类似神经元的状态。每三至四天更换一次标准细胞培养基。

采用等离子体光刻技术的典型结果是形成类似于任意或天然结构的细胞图案。此处图中显示了在条纹图案上用视黄酸诱导分化的神经元，即为一个实例。在此处另一幅图中，已构建出神经元的条带状结构及网络结构。除神经元外，其他细胞类型也可用于此技术，如下两幅图所示：此图展示的是人脐静脉内皮细胞，而此图展示的是C2C12骨骼肌细胞形成的网格结构，如图所示。

聚赖氨酸等材料也可进行图案化处理，以促进特定细胞类型的贴附及其他用途。在此方案基础上，可引入微流控、细胞探针或特定蛋白质的基因操作等额外手段，以回答更多科学问题，例如：多种刺激因素的组合如何影响高级结构及单个细胞的行为？