使用水相两相系统进行细胞共培养图案化

本实验的总体目标是在完全水性的环境中直接对细胞进行图案化。首先，将长链聚合物（如聚乙二醇和葡聚糖）分别溶解于含有细胞培养基的离心管中。第二步是用胰蛋白酶消化细胞，收集细胞沉淀，并将细胞以所需的接种密度重悬于一种或两种聚合物溶液中。

接下来，将聚合物溶液分配到细胞培养皿上。由于两种聚合物互不相容，可实现两种全水相液体的空间图案化。可在其中一种或两种聚合物溶液中加入细胞，以形成多种图案。

最后一步是在细胞贴壁培养四小时或更长时间后，去除聚合物溶液，并更换为培养基。最终可通过明场或荧光显微镜观察以确认细胞的图案化效果。该技术相较于微接触印刷等现有方法的主要优势在于，细胞是在完全水相的环境中进行图案化，且仅需使用微移液管图案等简单工具即可实现。

该方法可用于组织工程，以评估细胞迁移以及研究细胞间的旁分泌和自分泌信号传导。演示该实验步骤的是来自高山实验室的本科生 Abraham 和研究生 Joshua White。首先，将两种不同的聚合物溶解于实验中将要使用的特定培养基中。本示例中，聚乙二醇（又称 PEG）和葡聚糖（又称 Dex）的分子量分别为 35 千道尔顿和 500 千道尔顿。

在15毫升锥形管中制备16个2毫升样品，每个样品含有不同浓度的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（dex），类似于此处所示图表中的配比。具体操作为：根据图表称取相应量的PEG和葡聚糖，加入培养基中，轻轻摇动混合，直至两种聚合物完全溶解。聚合物完全溶解后，可能仍需数小时平衡时间。

溶液应呈浑浊状态。通过在1000 ×g 条件下离心样品5分钟，确认相分离。密度较大的下层为葡聚糖富集相。

上层相将富含聚乙二醇（PEG）。接下来，缓慢向各管中加入0.1毫升额外培养基，并将样品涡旋振荡20秒。然后再次离心样品以检查相分离情况。

加入额外体积的培养基后，溶液变得澄清，重复此步骤，每次加入0.1毫升培养基，混匀并离心样品，直至溶液澄清且不再发生相分离。这表明该特定混合物已达到临界点阈值。在此时记录每支试管的最终重量。

最后，确定两种聚合物在相分离点的质量百分比。绘制双节线，将聚乙二醇（PEG）的质量百分比置于纵轴，葡聚糖（dex）的质量百分比置于横轴。该曲线表示在此介质中 PEG 与 dex 发生相分离的临界浓度。

开始进行细胞排阻图案化时，需分别配制浓度为双倍临界点值的聚乙二醇（PEG）和葡聚糖（dex）溶液，该临界点值由双节结阈值确定。在本实验中，将5%（质量分数）PEG和12.8%（质量分数）葡聚糖加入含10%胎牛血清（FBS）和1%抗生素的DMEM培养基中。将试管置于摇床上，使其充分溶解。

接下来，收集本实验用于排斥图案化的细胞，即处于80%融合度的HeLa细胞，使用0.5%胰蛋白酶消化3分钟。收集后，用血细胞计数板计数细胞数量，然后离心并重悬于添加了5% PEG的培养基中，细胞浓度为每毫升375,000个细胞。该浓度可确保培养的样品在次日达到完全融合状态。

接下来，使用微量移液器将12.8%的Dex溶液以0.5 µL液滴的形式点样到干燥的96孔板上，用于排斥性图案化。Dex液滴可在无菌条件下干燥，以备后续使用。然后缓慢向孔中加入200 µL的PEG-Hela细胞悬液。

为了覆盖 D 液滴，首先需要用 PEG 溶液覆盖 D 液滴，然后再填充周围区域，这样可以防止溶液在扩散到孔中时破坏液滴。所有孔完成图案化并小心接种后，将细胞培养板放入加湿的培养箱中。操作过程中务必确保培养皿未倾斜，并将其放置在水平的培养箱架上，以避免在细胞贴附 12 小时后破坏已形成的图案。

移除 PEG 溶液，并用 200 微升培养基洗涤三次，以去除任何残留的聚合物。然后加入 200 微升新鲜培养基，将培养板放回培养箱。定期观察培养物，以监测细胞增殖及向排除区域迁移的情况，从而开始岛状图案化。

配制5%（质量/质量）PEG和12.8%（质量/质量）decks的细胞培养基溶液。同时收集用于岛状图案化的HeLa细胞，并再次使用血细胞计数板确定可用细胞的总数。随后离心收集细胞沉淀并重悬。

将细胞在培养基中以每毫升500万个细胞的密度进行旋转培养。若细胞贴壁效果不如HeLa细胞，则在含有12.8% dex的条件下，可能需要更高的细胞浓度才能在24小时内达到汇合。接下来，用移液器将200微升PEG溶液加入96孔板的每个孔中。

然后缓慢地在每个含有 PEG 溶液的孔中加入 0.5 微升的甲板细胞悬液液滴。液滴将沉至底部并与培养表面接触。随后小心地将培养板转移至培养箱中，注意在任何步骤中均不得倾斜培养皿，以免在 12 小时后破坏形成的图案。

移除 PEG 溶液，用 200 微升培养基洗涤三次。然后加入 200 微升新鲜培养基，将培养板放回培养箱。定期观察培养物，监测细胞增殖及从细胞岛向外迁移的情况。

开始共培养图案化实验，首先配制5%（质量分数）PEG和12.8%（质量分数）decks的DMEM溶液，其中含有10% FPS和1%抗生素。同时培养将用于排斥区和岛状图案化的两种细胞类型，使其接近汇合状态。本实验中，我们将使用Hep G2 C3肝细胞形成岛状结构，周围环绕NIH 3T3成纤维细胞。随后分别收集这两种细胞，并使用血细胞计数板进行独立计数。

这两种细胞类型可通过明场显微镜轻松区分。将 Hep G2 C3A 肝细胞用于成岛图案化，并重悬于 12.8% dextran 中。随后将成纤维细胞沉淀，用于排除、图案化，并重悬于 5% PEG 中。接下来，将 0.5 微升的 D 细胞悬液液滴加入干燥的 96 孔板中，然后轻轻覆盖 200 微升的 PEG 细胞悬液于 dex 液滴上。

12小时后将培养板转移至培养箱中。移除培养基，并用200微升培养液清洗三次。然后加入200微升新鲜培养液，将培养板放回培养箱。

最后，通过监测共培养体系中白蛋白染色强度，可用于评估成纤维细胞共培养的有益作用。形成多种水相两相体系所需的聚合物浓度可通过双节曲线来描述：当浓度高于双节曲线时，体系形成两相；当浓度低于双节曲线时，体系为单相。

该溶液是一种透明的单相两相体系，至少重复两次。位于双节曲线上的这些浓度足以用于本视频所述的水相两相体系。其第一个应用实例是排阻图案化，可在小区域内留下无细胞的空白区域。

岛状图案化产生与排他性图案化完全相反的效果，可在微小区域中接种细胞。这两种方法结合使用，可构建一种独特的共培养体系，使一种细胞形成的细胞岛被另一种细胞类型所包围，如此处所示。通过排他性图案化接种的HeLa细胞将增殖并迁移以填充空白区域。

随着时间的推移，可通过监测空隙大小的变化，深入了解细胞在不同条件下的迁移和生长行为。另一方面，岛状图案化可用于测量细胞的外向生长。

岛屿图案化与排他性图案化的结合可产生定义明确的共培养区域。图中显示的是被成纤维细胞包围的肝细胞岛。这些细胞集落已被发现在培养中至少四天内保持其组织结构。

利用该系统，可在同一块培养板上培养多个细胞岛。当肝细胞单独以细胞岛形式培养时，其白蛋白产量略低于与成纤维细胞共培养时的产量。在进行该操作时，需注意使用两倍临界浓度的聚合物浓度，以形成两相溶液。

观看本视频后，您应能充分理解如何构建水相双相系统，并利用该系统对细胞进行图案化以及定义几何结构。