使用单细胞RT-PCR技术分析黑质神经元中电压门控钾通道mRNA的表达谱

本实验的总体目标是检测单个神经元中的信使RNA。通过膜片钳技术记录单个神经元，随后将每个已记录神经元的细胞质完全吸出，以获取细胞质中的mRNA。然后以mRNA为模板合成cDNA，并通过PCR进行扩增。

最终，可以通过常规凝胶成像系统检测到编码受体、离子通道和酶的特异性 mRNA。我的名字是，我在田纳西大学健康科学中心工作。通常，刚接触该方法的人会遇到困难，因为单个神经元中的 mRNA 数量极微，极易丢失。

首先使用振动切片机切割包含黑质中前部的300微米厚冠状脑片。脑组织可取自15至40日龄的Sprague Dawley大鼠。切片过程需在冰上进行，使用冰冷的高蔗糖切片液，该溶液以95%氧气和5%二氧化碳混合气体饱和，并调节pH至7.4。切好的脑片随后置于人工脑脊液中孵育，并持续通入含5%二氧化碳和95%氧气的混合气体。

将温度维持在 34 摄氏度，使脑片在此条件下孵育 45 分钟。随后将脑片置于室温下保存，直至开始记录。首先将一片脑片转移至膜片钳记录浴槽中。

在32摄氏度下持续灌注含氧的人工脑脊液。使用经去DNA和RNA水配制的细胞内液填充膜片电极，并进行高压灭菌处理。将装有溶液的电极放入浴槽中。

检查电阻是否在2至3兆欧之间。首先，根据其独特的解剖位置确定黑质。然后使用namar光学系统和60倍物镜，选择黑质致密部（SNC）和黑质网状部（SNR）中的大细胞进行记录。

这些无疑是多巴胺能或 GABA 能神经元。采用常规的吉欧密封全细胞构型进行电流钳和电压钳记录。这些记录通常应在五分钟内完成，以最大限度地减少 mRNA 降解。

大约在一分钟内，通过仅记录目标神经元的膜特性和放电特性，即可提供其电生理学特征。在获取目标神经元的数据后，使用轻柔的口吸法吸出细胞质。在此过程中，应保持紧密封接不被破坏，否则将影响实验结果。

细胞外碎片（包括mRNA）可能被吸入膜片钳电极并污染细胞内容物。通过折断电极尖端并施加轻微正压，将细胞内容物排入0.2毫升PCR管中。操作完成后，立即将试管置于负20摄氏度冰箱中，以避免可能含有mRNA的细胞外碎片造成污染。

通过将膜片电极下降至组织中而不进行任何抽吸来收集内容物，制备阴性对照。从10到20个神经元之间立即收集细胞内容物后，开始逆转录反应。为最大限度减少mRNA的降解，首先在25°C下用DNase消化任何污染的基因组DNA约五分钟。

此步骤对于降低潜在假阳性结果至关重要，不得省略。随后，加入1.2 µL 25 mmol/L EDTA使DNA失活，并将样品在70°C下孵育5分钟。现在，使用市售试剂盒合成cDNA，以确认基因组DNA已完全去除。

对每个样本进行无逆转录酶的对照反应，其他反应组分保持不变。将产物储存于负20摄氏度，直至用于PCR设计时使用。

引物设计应依据 GenBank 中的序列，尽可能使引物跨内含子，以帮助检测基因组 DNA 污染。为验证引物对的有效性，首先在全脑 cDNA 上进行测试。采用标准热循环程序，对 30 微升 cDNA 中的 5 微升进行 PCR 扩增，共 35 个循环。

在第二阶段，取一微升第一阶段PCR产物，使用相同的引物进行PCR扩增，并采用稍作修改的循环程序。随后在2.5%琼脂糖凝胶上分离产物，利用溴化乙锭（AUM bromide）或Gel Green染色后观察。在紫外光下切下阳性DNA条带，使用市售试剂盒进行测序以回收DNA。

比较了黑质致密部和黑质网状部神经元的电生理特性。黑质网状部 GABA 能神经元表现出较高频率的自发性放电，频率约为 10 赫兹。在施加超极化电流后，动作电位的基底持续时间约为 1 毫秒。

SNR GABA能神经元表现出微弱的SAG反应，表明其激活的电流较弱。相比之下，黑质多巴胺能神经元表现出低频的自发性放电，其基础持续时间约为三毫秒。多巴胺能神经元在超极化刺激下未表现出明显的SAG反应，表明IH电流在SNR GABA能神经元中表达较强，而在多巴胺能神经元中则不显著。

单细胞逆转录聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）检测到谷氨酸脱羧酶1的mRNA，该酶是GABA合成的关键酶。相比之下，在鉴定出的黑质致密部（SNC）和黑质网状部（SNR）多巴胺能神经元中检测到酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase）的mRNA，后者是多巴胺合成的关键酶，但在GABA能神经元中未检测到。

接下来采用单细胞逆转录定量聚合酶链式反应（R-T-P-C-R）分析电压激活的 KV 3 钾通道亚基的表达情况，这些亚基可改变电压门控钾通道的特性。在示例 SNR gaba 神经元中，仅在单个 S-N-R-D-A 神经元中检测到 KV 3.1、3.2、3.3 和 3.4 的 mRNA。在合并的数据中检测到 KV 3.2、3.3 和 3.4 的表达。

KV 3.1 在 SNR GABA 能神经元中的检出频率高于黑质多巴胺能神经元，表明 KV 3.1 在快速放电的 SNR GABA 神经元中表达水平更高。在进行该操作时，务必记得佩戴手套，并在操作完成后保持工具的无菌状态。该技术为神经科学领域的研究人员探索神经系统中受体和离子通道的表达与功能奠定了基础。