制备、检测和使用成年脑组织切片中的钾离子选择性微电极

该技术的总体目标是制备、校准并使用单极性钾离子选择性微电极。利用此类电极可对成年动物脑片中诱发的钾离子浓度动态进行定量评估。该方法有助于回答生理学领域的关键问题，例如揭示中枢神经系统中钾离子稳态的细胞与分子机制。

该技术的主要优势在于，除了是一种简便直接的制备方法外，微电极传感器还是测量钾离子浓度的金标准。为准备用于硅烷化的硼硅酸盐玻璃毛细管，将其放入一个50毫升的锥形管中。向锥形管中加入1摩尔盐酸，将玻璃毛细管置于盐酸中，在温和振荡条件下孵育至少六小时，最好过夜。

随后，用70%乙醇短暂冲洗毛细管，然后在100至120摄氏度下完全干燥六到八小时。将清洗后的毛细管置于含有无水硫酸钙干燥剂的容器中，最多可保存四周以备后续使用。在进行硅烷化处理前，使用微电极拉制仪将毛细管拉制成细尖端。

然后，使用可耐受高压灭菌的胶带将微电极固定在玻璃容器内，使电极悬空于底部之上，以防止尖端破损。接着，采用氮气置换法从原容器中取出约 0.5 毫升的 5% DDS 硅烷化溶液。将气球充满氮气，并在气球上连接带有针头的注射器或导管。

然后，将针头插入DDS容器中，同时使用较长的针头将DDS抽入另一支注射器内。随后，将硅烷化溶液逐滴加至移液管的尖端，并立即盖上容器。将装有微电极和硅烷化溶液的容器置于预热的实验室烘箱中，在170至180摄氏度下孵育10至12小时，或在200至220摄氏度下孵育30分钟。

孵育结束后，将培养板从烘箱中取出。将培养板置于室温下的实验台上静置10至15分钟，使玻璃器皿冷却。从培养板中取出微电极，并将其放入装有干燥剂的密封容器中。

经过硅烷化处理的微电极若保持干燥，可在硅烷化后一周内使用。为活化电极，需配制钾离子载体混合液的储备液，并将其置于密闭不透光的容器中，室温保存。随后，配制 pH 7.4 的 10 毫摩尔 HEPES 缓冲液，其中含 300 毫摩尔氯化钠。

将电极固定在夹具上。随后，使用钝头工具将电极尖端刮至大约 10 到 20 微米宽，然后使用连接在注射器上的 28 号 MicroFil 尖端，用 HEPES 缓冲的氯化钠溶液反向填充电极。观察生理盐水溶液是否已到达微电极尖端末端，并确保微电极内无较大气泡，以免干扰电流流动。

使用微量移液器，在微电极尖端附近加入一小滴钾离子载体。如果电极已正确进行硅烷化处理，液滴将被吸入断裂的尖端内。用钾离子载体填充电极至约1毫米深度，并用滤纸吸去多余液体。

为校准微电极，实验开始前至少20分钟，需用95%氧气/5%二氧化碳气体对所有校准液和脑片缓冲液进行通气。开始以每分钟3毫升的流速向浴槽中灌注含有4.5毫摩尔钾离子的ACSF溶液。将钾离子选择性电极插入固定在操纵器电极头级上的电极 holder 中。

然后，将电极的尖端插入浴式灌流液中。确保银/氯化银接地电极也浸没在相同的溶液中，并保持液体流动稳定。逐步施加校准溶液，并记录电极尖端两侧以毫伏为单位的电位变化。

在切换至下一种溶液之前，等待电极尖端的电位达到稳定值。随后，测量校准溶液作用于电极尖端时的稳态电压变化。确认电极电压响应的斜率每十倍钾离子浓度变化至少为52毫伏，且不超过59毫伏。

为制备海马切片，从颅骨尾部开始沿中线切开皮肤，切口长度为2至3厘米。手动牵开皮肤后，从枕骨大孔处沿颅骨两侧各做一条长约1厘米的横向切口。然后，使用精细剪刀从颅骨后部沿中线向前剪至鼻部。

接下来，将精细镊子插入中线附近，将切开的颅骨分为两部分并进行牵拉。从颅骨中取出小鼠脑组织，使用刀片切除位于脑后部和前部的分别对应的小脑、前额叶皮层和嗅球。然后，使用超级胶水将脑组织块固定在振动切片机的载物盘上。

用冰冷的切割液填充振动切片机托盘。随后，在冠状面上将组织切成300微米厚的切片。通常可收集到4至6片冠状海马切片。

每切完一个脑片后，立即将其转移至预热至32至34摄氏度的切片保存烧杯中。将脑片在此温度下孵育20分钟，随后将装有脑片的烧杯转移至室温环境中，继续孵育至少20至30分钟，然后再进行记录。为检测钾离子动态变化，使用巴斯德移液管轻轻将脑片放入浴槽中，并用带有尼龙丝的铂金网格稳定固定脑片位置。

确保双极刺激电极的尖端彼此大致平行，并与脑片平面齐平。在5到7秒的时间内，缓慢将电极插入CA3区辐射层，深度约为40至50微米，以刺激Schaffer侧支。随后，在约3到4秒内缓慢下降，将钾离子选择性电极小心插入CA1区辐射层，深度约为50微米。

在对脑片施加刺激之前，需等待电极间的电位稳定，通常需要5到10分钟。如果脑片表现出过度的细胞外钾离子浓度自发变化，则应弃用该脑片，并使用新的脑片重复实验。为测量诱发的钾离子释放，通过刺激隔离器施加电刺激串，同时对反应信号进行数字记录。

以10赫兹频率、每脉冲1毫秒、起始刺激强度为10微安培的参数开始施加刺激。以2倍递增的方式逐步增加刺激强度，直至检测到最大钾离子反应幅度。若未观察到反应，则将钾离子选择性电极的位置向刺激位点方向每次移动100微米，逐步调整。

为了证实钾离子浓度的变化是由电刺激激活的Schaffer侧支产生动作电位所介导的，可在灌流液中加入0.5微摩尔的河豚毒素（TTX）于ACSF中，持续灌流10分钟，然后重复刺激方案。此时应无法记录到诱发反应。在用回填的HEPES缓冲盐溶液和钾离子载体对电极进行预处理后，可检测电极对浴液中钾离子浓度阶梯式变化的快速响应能力，以及在0.1至100毫摩尔的校准范围内，钾离子浓度变化所引起的线性响应，该响应特性应符合能斯特方程的预测。

可以通过绘制稳态电位与浴液中钾离子浓度的关系曲线来确定曲线的斜率，该斜率应约为58.2毫伏，且每增加十倍钾离子浓度时不应低于52毫伏。进一步测试了钾离子选择性电极的响应性，观察到当钾离子浓度增加5.5毫摩尔时，其上升和衰减的时间常数均约为85毫秒。当刺激电极和钾离子选择性电极已置入组织，并且记录信号达到稳定基线后，即可施加电流强度逐渐增加的脉冲刺激。

该活动的波形表现为钾离子快速上升并伴随指数衰减，此现象在应用河豚毒素（TTX）后消失。一旦掌握该技术，若操作仔细准确，整个过程大约需要三到四小时。在进行该操作时，需注意保持电极尖端尽可能细小，以实现精确记录，同时又需足够大以降低噪声。