成像与定量分析基因修饰细胞中的蛋白质聚集体 果蝇 大脑

从基因改造的果蝇大脑开始。这些大脑中的神经元表达一种带有红色荧光标记的突变蛋白，该蛋白可扩散至周围的胶质细胞，导致胶质细胞表达带有黄色荧光标记的正常蛋白，从而引起蛋白聚集。

加入一种能够保持细胞完整性的固定剂溶液。

去除固定剂，并用缓冲液洗涤。

加入抗荧光淬灭剂并孵育，以防止荧光信号衰减。

将脑组织转移至载玻片上，并去除多余液体。

让脑组织贴附在载玻片上。

使用盖玻片的小碎片作为间隔物，将盖玻片置于其上。加入抗荧光淬灭试剂并封片。

在共聚焦显微镜下，使用不同的激发波长采集红色和黄色荧光的图像。

使用图像分析软件定量分析蛋白质聚集体。

红色与黄色荧光的共定位表明突变蛋白的扩散。

所有脑组织解剖完成后，将收集管转移至室温下的旋转混合仪（nutator）中，轻轻摇动约5分钟。固定结束后，使用P1000移液器吸除大部分固定液并弃去，操作时需格外小心，确保脑组织保留在管内。此步骤需轻柔抽吸并仔细观察。

接下来，向脑组织中加入1毫升新鲜的PBST。盖好管盖，置于摇床上轻轻摇动约1分钟，以洗去残留的固定剂。然后移除溶液，并重复此短暂洗涤步骤一次。

在两次短暂清洗后，进行一次5分钟的清洗，接着进行三次每次20分钟的清洗，最后进行一次1小时的清洗。最后一次清洗后，小心吸除大部分PBST，将脑组织浸入30微升基于甘油的抗荧光淬灭试剂中。然后，在4摄氏度避光、无扰动条件下孵育脑组织1至24小时。

随后，使用钝化枪头从收集管中取出脑组织，并将其转移至显微镜载玻片上。然后，用镊子根据成像需要轻轻调整脑组织的方向。多个样本可分别置于同一载玻片的不同排中进行固定。

接下来，使用折叠的实验室纸巾的角落从载玻片上除去多余的抗荧光淬灭试剂。注意不要让纸巾接触到脑组织。然后，将样品置于暗处静置 5 至 10 分钟，使脑组织贴附于载玻片上。

接下来，取少量破碎的盖玻片碎片，将其放置在脑组织周围，覆盖面积约19平方毫米。然后，轻轻将一块22平方毫米的盖玻片覆盖在脑组织与玻璃碎片组成的镶嵌结构上，制成桥式装片。接着，缓慢将新鲜的抗荧光淬灭试剂滴加在盖玻片下方，使其填充所有空隙。操作时需格外小心，确保脑组织和玻璃碎片保持原位。随后，用指甲油密封盖玻片。首先仅在四个角处涂抹，待角部的指甲油滴干燥5至10分钟后，再沿边缘完成整体密封。脑组织应尽快进行成像。

使用配备40倍或63倍油镜物镜的共聚焦显微镜对安装好的脑组织进行成像，采集转基因表达脑区的z轴序列光学切片。随后，可通过定量分析单个z轴切片中的斑点信号，或在将切片重建为三维图像后进行数据分析。

为了定量分析分离良好且背景信号较低的突变亨廷顿蛋白聚集体，首先在3D 查看模式下打开共聚焦z序列图像，然后使用分析向导在选定通道中识别单个信号点。

在设置中，调整阈值和滤镜，以准确地将图像中所有大小不均的聚集体表示为独立的物体。然后，在二值化处理预滤镜下启用分割物体功能，以分离紧密相连的聚集体。软件识别出的物体的定量信息将在测量部分中报告。

计数荧光点后，在图像分析软件中进一步对其进行表征。例如，对斑点或表面进行相关测量，以获取聚集体的直径、体积或强度信息。一些野生型亨廷顿蛋白聚集体可通过手动浏览z轴层叠图像，并计数可与周围弥散信号区分开的绿色荧光点来进行定量分析。

当同一聚集体在多个切片中出现时，需注意避免重复计数。另一项值得关注的分析是确定亨廷顿蛋白Q25-YFP与亨廷顿蛋白Q91-mCherry聚集体之间的共定位频率。可通过逐层移动共聚焦z轴图像堆栈，进行手动计数来完成此分析。