Drosophila 幼虫盘肿瘤模型：利用遗传镶嵌体可视化与定量分析基因表达及肿瘤侵袭性

本实验方案的总体目标是演示如何解剖携带基因定义的荧光标记克隆的果蝇眼-触角成虫盘和大脑，并对其进行处理以观察和量化基因表达变化及细胞侵袭性。所述操作步骤有助于深入理解基因在上皮发育、稳态或疾病中的作用，并解析其克隆间竞争、补偿性增殖或克隆间协作的潜在机制。本研究的主要优势在于提供了一整套专门针对果蝇遗传嵌合体进行深入定性和定量分析的实验方案。

通常，初次使用果蝇模型的研究人员会遇到困难，因为他们无法将眼-触角成虫盘与其他成虫盘区分开来。为了便于识别幼虫体内带有荧光标记克隆的眼-触角成虫盘，建议在荧光显微镜下进行初步解剖。利用可抑制细胞标记物的镶嵌分析（MARCM）技术，可以在整体表型为野生型的背景下，产生遗传上明确界定的克隆区域。

由眼less启动子驱动的FLP在两侧带有黄色基因标记的FRT元件之间催化停止盒的重组。DNA复制后，FLP催化同源染色体之间的非姐妹染色单体交换，产生姐妹染色单体：一条携带野生型等位基因和Gal80阻遏蛋白，另一条携带突变型等位基因。

在有丝分裂中，这些细胞分离产生两个子细胞，其中一个为纯合突变体，另一个为野生型。Gal80 抑制因子的缺失使得突变体中能够表达 GFP，而野生型细胞则保持 GFP 阴性。实验开始时，通过将 PBS 喷入果蝇培养瓶以覆盖培养基表面，收集嵌合幼虫。

然后用刮铲软化顶层，将含有幼虫的食物浆液倒入培养皿中。轻轻挑取幼虫，并转移至盛有PBS的胚胎培养皿中。用于免疫染色的幼虫至少收集20只，用于肿瘤侵袭性定量分析的幼虫至少收集80只。

用 PBS 清洗幼虫，以去除所有残留的食物。在 8:16 倍放大倍数的荧光体视显微镜下，识别并剔除所有豹纹型幼虫，即全身呈现随机绿色荧光蛋白（GFP）阳性斑点的幼虫。将含有剩余幼虫的培养皿置于 PBS 中，并放在冰上，直至进行解剖。

在体视显微镜下解剖眼-触角成虫盘时，使用一对镊子轻轻夹住幼虫头部后约体长2/3处。用第二对镊子夹住幼虫的口钩并将其从身体上拉开。用镊子将口钩从覆盖的表皮以及唾液腺和脂肪体等多余组织中分离出来。

或者，为了制备保持腹神经索完整的眼-触角盘脑复合体，可用镊子在幼虫身体中部剪断，弃去后半部分。用一对镊子的尖端夹住幼虫前半部分，然后用第二对镊子的尖端将口钩向内推，同时用第一对镊子将表皮翻卷包裹其上，从而将幼虫内翻。

仔细去除所有多余组织，包括肠道、脂肪体和唾液腺。轻柔地将口钩从角质层上分离。切断腹神经索延伸至肌肉和表皮的轴突投射，释放附着在口钩上的眼-触角盘脑复合体。

转移组织时，先用P20微量移液器吸头吸取残留的体部 carcasses，反复吹打数次以预润吸头，然后使用同一吸头转移已解剖的组织。对于较大的眼-触角盘脑复合体，可预先剪切P20吸头以扩大开口。将样品置于400 µL的4% PFA固定液中，在室温下以振荡方式固定25分钟。

然后去除固定液，用 PBST 在振荡条件下清洗样品三次，每次 10 分钟。接着将 PBST 替换为 500 µL 的 DAPI 染色液，在避光条件下振荡孵育 15 分钟。最后用 PBST 清洗组织一次，每次 10 分钟。

完成解剖时，使用一支1毫升移液枪将组织转移回盛有PBS的玻璃培养皿中。用两对镊子剪断视神经束，将用于侵袭性定量分析的脑组织与眼-触角原基分离。通过剪除口钩上的组织，游离眼-触角原基。

在一张离体载玻片上滴加一滴封片介质，并用镊子将液体铺展成均匀的薄层。为定量分析侵袭性，将每种基因型的至少80个固定完整的脑组织置于同一张载玻片上。根据需要调整并固定组织的位置。

用镊子轻轻将盖玻片的一边接触封片剂，然后缓慢放下，以避免产生气泡。用实验室擦拭纸吸去边缘多余的封片剂。现在可使用共聚焦成像观察组织。

请一位中立的第三方对切片进行匿名化处理，以确保评分的无偏性。并由至少两名研究人员独立评估切片。仅在完成评分后披露基因型信息。

在配备 GFP 滤光片的荧光体视显微镜下评估恶性程度。使用记号标记已观察过的脑组织，以避免重复计数。荧光共聚焦图像显示从携带恶性 RAS V12 scribble 突变体 GFP 标记克隆性肿瘤的幼虫中解剖出的脑组织，经 DAPI 染色。

图示为肿瘤侵袭性的四种不同等级。无偏倚的定量分析显示，JNK 信号通路的抑制以及 RAS V12 scribbled one 克隆能够抑制肿瘤的侵袭性。在对照组的眼-触角碟形体中，JNK 敏感型 TRE-DsRED 报告基因仅标记出一条狭窄的细胞带，从触角部分延伸至眼部区域。

相比之下，在GFP阳性的恶性克隆肿瘤中，TRE-DsRED活性显著增强。至第8天，肿瘤细胞已过度生长并覆盖眼-触角盘，且扩散至腹神经索。与周围组织相比，侵袭性肿瘤细胞还表现出JNK活化水平升高。

尽管阻断JNK明显降低了肿瘤克隆中TRE-DsRED的活性，但提高激光强度后发现克隆周围上皮细胞的信号增强。此外，hemolectin delta DsRED报告基因显示，与对照组眼-触角上皮凹陷处仅存在少量血细胞簇不同，血细胞在由恶性肿瘤组成的眼-触角及脑组织中大量聚集。当抑制JNK后，相关免疫细胞的数量显著减少。

增强的肿瘤侵袭性、JNK 活性以及血细胞浸润伴随着 MMP1 mRNA 的显著上调，该结果通过 qRT-PCR 检测自解剖获得的嵌合眼-触角盘中提取的总 RNA 得到证实。熟练掌握后，可在 30 分钟内解剖超过 60 对眼盘和脑组织。在进行此操作时，重要的是要记住需产生足够数量的目标基因型幼虫。

解剖时需迅速而精确，以确保用于RNA提取的样品免受RNase污染。完成解剖后，可采用蛋白质印迹法（Western blot）作为免疫染色的替代方法，以评估不同基因型之间蛋白质表达水平的变化。通过构建遗传嵌合体并利用所述方法进行分析，可研究原本致死的突变以及癌基因协同作用的机制。观看本视频后，您应能充分掌握如何从三龄幼虫的眼-触角成虫盘和脑组织中解剖嵌合组织，并掌握后续进行免疫染色、转基因标记及报告基因活性的可视化、RNA提取以及侵袭性定量分析的处理方法。

请注意，PFA、苯酚-氯仿和 DAPI 均具有高毒性，操作这些试剂时必须采取预防措施，例如佩戴防护手套和防护服。