从小鼠缺血性脑组织获取细胞悬液

0 次观看3:47 分钟 • July 8th, 2025

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取灌注的缺血小鼠脑组织,其中包含脑细胞和浸润的免疫细胞。

在滤网上切碎组织,并用缓冲液冲洗。

离心滤液并弃去上清液。

将沉淀重悬于消化酶溶液中,并转移至微量离心管。

孵育以使消化酶降解细胞外基质,从而松解细胞。

用含有DNase的缓冲液过滤悬浮液并冲洗,以去除污染的DNA。

接着,用无DNase的缓冲液洗涤。

离心滤液并弃去上清液。

将细胞重悬于密度梯度介质中。然后将内容物转移至新的离心管并混匀。通过离心按密度分离各组分。

去除含有髓鞘和碎片的上清液。

将沉淀重悬于无DNase的缓冲液中。转移至新管,再次离心。

弃去上清液,以确保充分去除密度梯度介质。

最后,将细胞重悬于缓冲液中,用于后续分析。

使用5毫升注射器的推杆端,将脑组织碎片通过100微米细胞筛网研磨,并持续用含钙和镁的冰冻HBSS冲洗筛网。然后将匀浆后的组织置于冰上。

当所有样品处理完毕后,离心细胞悬液,并小心弃去上清液。将沉淀重悬于1毫升消化缓冲液中,然后将细胞悬液转移至2毫升离心管中。

在37摄氏度下将细胞置于缓慢连续旋转环境中孵育。一小时后,将细胞悬液通过70微米的细胞筛网过滤。用含有DNase的3毫升洗涤缓冲液彻底冲洗滤膜。然后用15毫升不含DNase的洗涤缓冲液冲洗筛网。离心收集细胞,并弃去上清液。

为了去除细胞碎片和髓鞘,将细胞重悬于5毫升室温的25%密度梯度培养基中,并将细胞悬液转移至15毫升离心管。通过反复轻柔吹打充分混匀细胞与梯度培养基。然后离心收集细胞溶液。

分离结束后,小心吸除髓鞘层和上清液,注意不要扰动沉淀。将细胞重悬于 10 毫升无 DNase 的洗涤缓冲液中。将细胞转移至 15 毫升离心管,再次离心,然后将沉淀重悬于 100 微升预冷的洗涤缓冲液中。

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最后更新:22 八月 2026