短暂性或永久性脑缺血模型中白细胞亚群的体视学与流式细胞术表征

本实验的总体目标是通过两种不同方法对缺血性脑组织中的小鼠髓系细胞亚群进行表征。首先，通过闭塞颈总动脉（CCA）和大脑中动脉（MCA）远端主干，建立永久性脑缺血模型，从而产生主要累及脑皮层的梗死灶。随后，为对髓系细胞亚群进行体视学定量分析，对脑组织进行连续冠状切片，并对目标细胞进行免疫染色，再采用光学分数法对浸润的细胞进行定量。

或者，可通过机械解离法从新鲜脑组织中分离髓系细胞，随后进行染色并利用流式细胞术分析。最终，可通过立体定量法和多参数流式细胞术分别实现对脑缺血后浸润小鼠脑组织的特定髓系细胞亚群的准确定量和详细的定性表征。相较于其他现有模型，该缺血系列模型的主要优势在于，我们的技术显著降低了死亡率，从而减少了研究所需的动物数量。

该领域需要一种方法来回答脑卒中研究中的关键问题，例如：微循环再通、血液来源的巨噬细胞或中性粒细胞外渗在脑损伤中发挥什么作用？本文所展示的多参数流式细胞术的精确免疫表型定量分析，可为髓系细胞群体在脑梗死先天免疫反应中的数量、表型及功能提供深入见解。为结扎颈总动脉（CCA），首先在手术显微镜下于动物颈部腹侧正中做一长约1厘米的切口。

解剖完成后，使用6-0尼龙缝线通过永久结扎法闭合左侧颈总动脉（CCA），以结扎远端大脑中动脉（MCA）。接着，从右向左在颞肌上做一横向切口。然后，在颞肌右侧做第二个纵向切口。

注意避免损伤颞静脉。将颞肌从颅骨上分离，并用缝线牵开，以保持颅骨表面清洁。随后用冷的无菌生理盐水清洗颅骨，利用颅骨的透光性确定左侧大脑中动脉（MCA）的准确位置。

确定大脑中动脉（MCA）后，使用不锈钢钻头在颧弓与鳞状骨之间的额叶区域进行直径为1毫米的圆形颅骨开窗。小心去除颅骨，暴露大脑中动脉。然后使用9-0尼龙缝线，在大脑中动脉分叉前方的远端主干处对左侧大脑中动脉进行永久结扎阻塞。

为取出脑组织，将已处死的小鼠在脊髓上方剪断头部，并在皮肤上做一从前向后的切口以暴露颅骨。然后在颅骨侧壁与颅底交界处做两个侧向切口，并移除小块骨片。接着沿矢状缝在颅骨上剪开，用镊子分别去除覆盖两侧大脑半球的颅骨，以暴露脑组织。

使用刮勺将脑组织从颅骨中分离，并转移至4% PFA溶液中。三小时后，移除PFA溶液，将脑组织置于30%蔗糖溶液中孵育，以进行冷冻保护。48小时后，移除蔗糖溶液，将脑组织在-40°C的异戊烷中快速冷冻，随后使用冷冻切片机切出30微米厚的冠状脑切片。

在冷冻保护液中收集10套连续切片，每套连续切片包含约14至16个冠状面切片，切片间距为300微米。为充分取样小鼠脑组织（位于bgma后方1.94至负2.46之间），以估算浸润性中性粒细胞的总数。

通过光学分馏器进行大脑中动脉阻塞后，首先采用常规免疫荧光技术，在漂浮切片上使用大鼠抗LY6G抗体及相应二抗对中性粒细胞进行免疫染色。然后将脑切片贴附于超冻载玻片上，使梗死区域位于右侧，并打开Stereo Investigator软件。接着，点击工具栏中的“连续切片管理器”菜单，通过“新建切片”按钮添加一个新的切片。

将评估间隔设置为 10，以获得十分之一的采样比例。然后从轮廓下拉菜单中选择梗死区域轮廓工具。在 10 × 物镜下绘制轮廓以勾勒出梗死区域的边界。

然后在显微镜上切换至100倍物镜，并在物镜菜单中进行相应设置。在探针菜单下定量中性粒细胞时，选择光学分数法器，将计数框的XY放置间距在X和Y方向的网格尺寸均设为230。接着从标记工具栏中选择中性粒细胞按钮，标记梗死区域中染色的中性粒细胞。

将定量结果导出至电子表格文件，以将脑组织解离为单细胞悬液。按照上述方法取出脑组织后，从脑缺血小鼠脑中分离出同侧皮层的梗死核心区域及周边区域。称量脑组织重量，并将其置于每份五毫升的冰冻RPMI培养基中，以便在实验组之间进行归一化处理，然后使用带有聚四氟乙烯研杵的组织研磨器将组织解离为单细胞悬液。

将细胞悬液转移至50毫升超速离心管中，并向每份细胞悬液中再加入5毫升RPMI培养基。随后在25摄氏度下以7,800 ×g离心30分钟。离心后确保溶液顶部出现一层白色物质，该层即为髓鞘层。

小心去除髓鞘层，并将整个细胞悬液（包括沉淀的细胞）通过40微米尼龙滤网过滤。用10毫升RPMI冲洗滤网，以确保所有细胞均通过滤网，然后将滤液转移至50毫升离心管中。向细胞中加入20毫升RPMI，离心后重悬白细胞沉淀。

在室温下，将细胞加入含有4毫升裂解缓冲液的1毫升PBS中孵育2至3分钟，以裂解红细胞，随后离心沉淀细胞。在冰上，用含有1% BSA和适量抗体的200微升PBS对细胞进行标记。45分钟后，用1毫升冷PBS洗涤样品，并将细胞沉淀重悬于100微升流式缓冲液中，用于流式细胞术分析。

该模型在大脑中动脉闭塞后24小时，通过卡瓦列里法估算，梗死体积具有高度可重复性。在尼氏染色切片中，中性粒细胞浸润与梗死面积直接相关，这与以往研究结果一致。此外，通过白细胞分离和流式细胞术表征，可从缺血小鼠病变半球的皮层中分离出髓系细胞，这些细胞占细胞悬液中总事件数的10%至30%，并表现出与细胞碎片相关的低前向散射参数。

CD11b阳性细胞具有较高的前向散射值，表明细胞碎片不被该标记物标记，如前所述，可通过将FSC阈值设为200，从而在后续分析中排除这些碎片。中性粒细胞被定义为LY6G阳性细胞，在此脑缺血模型中，于大脑中动脉闭塞后24小时，在缺血小鼠脑组织中是最主要的浸润细胞群体，占CD11b阳性、CD45高表达细胞的70%至80%。其余细胞主要为CD11b阳性、CD45高表达、LY6G阴性、CCR2高表达的促炎性单核细胞亚群，在大脑中动脉闭塞后24至48小时，其数量在缺血脑区显著升高。若操作得当，此P-M-C-A-O模型可在30分钟内完成，紧随流式细胞术操作流程之后进行。

还可以采用其他方法，例如分选特定的细胞亚群，以回答更多问题，比如在此模型系统中，髓系细胞的表达模式、代谢变化或乙酸活性如何。观看本视频后，您将能够充分了解如何构建缺血模型，以及最重要的是，如何通过两种不同方法对小鼠脑损伤或脑缺血后 tpe 模型中浸润性髓系细胞的数量和表型进行表征。