为何要检测线粒体呼吸链亚基以进行靶点验证？

定量线粒体呼吸链复合体亚基可评估靶点结合效应对神经元能量代谢的影响，从而支持神经退行性疾病项目中的机制性风险降低。

将线粒体蛋白表达分离为独立变量如何支持发现研究流程？

分离线粒体蛋白表达可使研究人员将特定靶点或化合物与能量代谢的变化联系起来，从而在早期发现阶段阐明其生物学功能。

线粒体DNA水平的定量测量在神经元研究中能够实现什么？

定量线粒体DNA测量可作为线粒体含量和生物发生的替代指标，能够对功能读数进行标准化，并评估细胞器密度。

为什么在跨功能协作的线粒体分析中，重复性要求至关重要？

重复实验可确保不同团队和实验地点之间线粒体参数定量结果的一致性和可重复性，从而在靶点验证和检测方法开发中支持可靠的数据传递。

在实施该流式细胞术方法之前，需要具备哪些统计分析能力？

实施需要具备分析平均荧光强度、计算变异系数以及应用统计学方法比较不同实验条件下线粒体蛋白表达水平的能力。

使用流式细胞术测量神经元中的多个线粒体参数

JoVE Encyclopedia of Experiments

神经科学

0 次观看 • 2:09 分钟 • July 8th, 2025

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取固定并通透化的神经元置于离心管中。

加入封闭缓冲液以防止非特异性抗体结合。

离心悬浮液并弃去上清液。然后，将神经元重悬于缓冲液中。

将悬浮液等量转移至含有未标记和荧光染料标记的一抗的离心管中。

孵育，使抗体特异性结合神经元内的线粒体呼吸链或MRC复合物亚基、线粒体DNA相关蛋白以及线粒体外膜蛋白。

去除未结合的抗体。

使用与未标记的一抗结合的荧光标记二抗进行孵育。

离心混合物并弃去上清液。

用缓冲液重悬神经元，并转移至微量离心管中。

通过流式细胞术检测标记神经元上的荧光信号，以反映MRC复合物亚基的表达水平及线粒体DNA相对含量的测定。

用1毫升封闭缓冲液封闭样品，并如所示通过离心法用PBS洗涤细胞。为检测不同的线粒体复合物及亚基，将细胞与文中所述相应的初级抗体在30分钟内孵育。用PBS洗涤细胞一次后，将细胞与二抗孵育30分钟。

孵育结束后，按照所示方法用 PBS 洗涤细胞并将细胞重悬于 PBS 中。将细胞悬液转移至 1.5 毫升微量离心管中，置于冰上并避光保存。随后，使用流式细胞仪分析细胞，通过 530/30 带通滤光片检测信号并进行过滤。