基于多色流式细胞术的T细胞线粒体与溶酶体定量分析

该方法有助于我们解答免疫代谢领域中的关键问题。此技术的优势在于，可在多种不同类型细胞的复杂混合物中，对单个活细胞内的线粒体或溶酶体进行定量分析。这种研究T细胞和B细胞的方法也可应用于许多其他细胞类型，例如巨噬细胞、树突状细胞，或从组织样本中分离的任何原代细胞。

该实验步骤将由我实验室的研究生Chin-Wen Wei进行演示。为了对细胞器进行标记以用于定量分析，首先将1×10⁶个鼠源T细胞加入到一个圆底离心管中，每个标记对应一管。然后通过离心使细胞沉淀。

使用预热至 37 摄氏度的无血清培养基，将细胞器特异性探针的储备液稀释至培养基中的最终工作浓度。每管中用 100 微升探针染料重悬细胞。接下来，将细胞置于细胞培养箱中孵育适当的染色时间，孵育结束时每管加入 1 毫升冰冻 FACS 缓冲液以终止反应。

随后，通过另一次离心收集细胞，并将沉淀重悬于 100 微升预滴定的 24G2 杂交瘤上清液中，置于冰上。10 分钟后，每管加入 1 毫升 Fax 缓冲液。通过离心收集细胞，并用 50 微升预滴定的荧光标记抗体混合物对细胞进行标记。

根据表格加入相应浓度的试剂。将染色缓冲液置于冰上避光孵育20分钟。孵育结束后，每管加入1毫升染色缓冲液。

通过离心收集细胞。将细胞重悬于300 µL Fax缓冲液中，缓冲液中添加1 µg/mL的碘化丙啶。加入细胞核和染色体复染剂后，立即打开流式细胞仪分析计算机、流式细胞仪、Fax数据采集软件以及根据仪器平台所需的其他附属设备。

用 PBS 运行系统约一分钟，以确保流路中充满 PBS 和鞘液缓冲液。新建一个实验，并根据制造商的说明设置流式细胞仪参数。通过 70 微米细胞滤网过滤细胞。

在采集每个样本前进行涡旋振荡，以避免团块和双联体的形成。打开自动补偿设置，并为每个荧光参数创建点图。在所有电压设置完成后，调整补偿并将其应用于样本。

创建前向散射光与侧向散射光的散点图，并优化电压，使目标细胞位于图中合适位置。创建前向散射光面积与前向散射光高度的散点图，并圈选单细胞群体。创建前向散射光面积与侧向散射光面积的散点图，并圈选淋巴细胞。

创建前向散射面积与碘化丙啶的散点图，并圈选活细胞。在所有电压设置完成后，调整补偿并将其应用于样本。然后加载第一个样本管，创建相应的细胞表面标志物散点图，并至少收集目标细胞群的 1,000 个事件。

当所有样本运行完毕后，导出流式数据以供后续分析。并将该实验保存为模板，以便将来在类似实验中保留细胞仪的设置和参数。最终的线粒体含量在双阴性一型T细胞中最低，在双阴性第二和第三阶段达到峰值，在双阴性第四阶段略有下降。

双阳性胸腺细胞的线粒体数量高于CD4和CD8单阳性胸腺细胞，表明线粒体含量在发育过程中会发生波动。CD4和CD8单阳性胸腺细胞的线粒体平均荧光强度高于脾脏CD4或CD8 T细胞，提示在富氧血液环境中再循环的初始T细胞其线粒体质量比胸腺细胞更低。有趣的是，CD8 T细胞谱系中的线粒体含量减少比CD4 T细胞谱系更为显著，且T细胞活化会进一步降低这些细胞器的存在。

所有胸腺细胞群体中均观察到相对较低但可检测到的溶酶体含量，其中双阴性一型胸腺细胞中的溶酶体含量更为显著。在外周部位，记忆性和效应性CD8阳性T细胞中检测到相对较高数量的溶酶体。将细胞器特异性染料与表面标志物结合流式细胞术，是表征复杂混合物中细胞代谢状态的一种强有力方法。

可使用其他细胞器特异性染料来检测内质网、自噬性空泡或其他感兴趣的细胞内区室。