解析模型疱疹病毒裂解复制中的宿主-病毒相互作用

以下实验的总体目标是利用多种病毒学和生物化学方法，解析宿主信号通路在模式疱疹病毒裂解性复制过程中的作用。在此，我们以线粒体抗病毒信号蛋白 Mavs 在 γHV68 疱疹病毒感染过程中的作用为例进行研究。首先，为了研究 Mavs 在急性感染期间的作用，将野生型小鼠和 Mavs 基因敲除小鼠感染 γHV68，以建立急性病毒感染模型。

收集小鼠肺组织，并通过蚀斑实验测定病毒载量，其中样本经连续稀释后接种于单层细胞。在单层细胞上计数蚀斑数量。基因敲除小鼠中病毒载量的增加表明该目的基因具有抗病毒作用。

相比之下，基因敲除小鼠中病毒载量的降低表明该基因是病毒感染所必需的。为验证这一发现，在小鼠胚胎成纤维细胞中进行体外病毒多步生长动力学分析：将野生型和 mavs 基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞感染 gamma HV 68 病毒，并在不同时间点进行培养。随后收集细胞，通过空斑实验比较野生型细胞与 mavs 缺陷型细胞之间的多步生长动力学差异。

为了进一步验证这些发现，我们用γ疱疹病毒68（gamma HV 68）感染野生型和mavs基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞。随后从感染的细胞中分别提取DNA和RNA，并通过实时PCR分析病毒基因组转录本。当我们研究宿主免疫通路在病毒裂解性感染过程中的作用时，首次提出了该实验方案的想法。

该方案可潜在地用于研究其他病原体感染过程中宿主信号通路的调控规律。实验开始前，将六至八周龄、性别匹配的同窝小鼠在运输后于实验环境中适应四天。以下实验将在生物安全设施中进行。

准备阶段，在生物安全二级柜中穿戴个人防护装备，包括实验服、手套、口罩和鞋套。为每只需要感染的小鼠准备含有 40 至 10,000 PFU 的 gamma HV 68 病毒及 30 微升无菌 PBS 的病毒悬液。

在腹腔注射氯胺酮-赛拉嗪后，将病毒悬液保持在冰上。通过脚趾夹捏测试确保小鼠已进入麻醉状态。然后使用移液器将30微升病毒悬液逐滴加入左侧或右侧鼻孔中。

将小鼠侧卧放置5至10分钟，以促进病毒经气道递送至肺部。随后将小鼠放回笼中，并持续观察直至其从镇静状态完全恢复。接着采集注射小鼠的肺组织，制备细胞裂解液，用于检测感染后不同时间点的病毒滴度。

将安乐死小鼠的肺组织放入预冷的无菌1.5毫升螺口管中，管内含500微升1.0毫米氧化锆-二氧化硅珠，置于冰上。若当天不进行下一步操作，将样品于-80摄氏度保存。

否则，加入一毫升冰冷的无血清DMEM。将离心管放入珠磨机中，按下启动键，匀浆肺组织30秒。为避免样品过热导致病毒失活。

匀浆30秒后，将离心管置于冰上冷却至少1分钟。然后重复此过程。接下来，将匀浆后的组织在4°C条件下以16,000 RCF离心1分钟。

离心后，细胞碎片将位于管底，而脂质将位于液体表面。立即吸取上清液，如图所示，使用 NIH 3T3 或 BHK-21 单层细胞进行蚀斑实验。接下来，通过对接种病毒的上清液进行系列稀释，开始蚀斑实验，以测定样品中的病毒滴度。

首先使用多通道移液器向96孔板中每孔加入270微升培养基，第一行留空。然后将上清液每样三复孔加入96孔板的第一行，每孔200微升。

接下来，将第一行中的30 µL样品转移至下一行并混匀。然后将30 µL的混合液转移至下一行并混匀。重复此步骤多次，以进行10倍系列稀释。

接下来，将稀释后的病毒上清液加入细胞单层中，使用24孔板。将该板放入培养箱中，在2小时的孵育期间每30分钟摇动一次。孵育结束后，为去除细胞碎片，吸出孔板中的上清液。

然后用新鲜培养基洗涤细胞一次。洗涤后，向细胞中加入含有甲基纤维素的培养基。将细胞培养4至6天。

经过四到六天后，使用显微镜读取每个样本的噬斑数量。记录每个稀释度的噬斑数。

然后计算平均值和标准差。含有过多或过少噬斑的孔无法用于准确计算滴度。因此，对于每个样本，应使用含有7到70个噬斑的稀释度。

此样品稀释1000倍后，每孔平均有23个噬斑。要计算未稀释溶液中的病毒滴度，需将稀释倍数乘以噬斑数，再乘以每毫升中的微升数，然后除以每孔加入的稀释上清液体积。

因此，在本示例中，1000 乘以 23 个噬斑乘以每毫升 1000 微升，再除以 100 微升，等于每毫升 2.3 × 10⁵ 形成单位。接下来，使用已知滴度的病毒储备液来确定 gamma HV 68 在小鼠胚胎成纤维细胞中的生长动力学。实验开始时，将野生型细胞和缺乏某种宿主基因的细胞分别以每孔 10,000 个细胞的密度接种至 24 孔板中。次日，将每孔中的培养基更换为 0.5 毫升低感染复数（MOI）的 gamma HV 68 悬液。

将培养板置于37摄氏度的培养箱中，持续孵育两小时。孵育结束后，每30分钟轻轻摇动培养板一次。使用移液器吸除病毒悬液，并向感染病毒的细胞中加入0.5毫升含有8%胎牛血清的新鲜完全DMEM培养基。

在感染后的不同时间点将细胞放回培养箱中。通过反复吹打收获培养基中的细胞，并立即转移至无菌的1.5毫升离心管中，随后将离心管在-80摄氏度下冷冻，以释放Mets中的γHV68。

进行三次冻融循环。将细胞置于37摄氏度条件下解冻，然后涡旋振荡，再放回-80摄氏度冰箱中。

通过噬斑实验测定病毒滴度，使用 NIH 3T3 或 BHK-21 单层细胞（如前所述），以检测宿主基因或病毒基因缺陷是否影响 DNA 或 RNA 的复制。从感染后不同时间点的感染细胞开始，弃去上清液，用冷 PBS 洗涤细胞，并用胰蛋白酶在冰上处理细胞。随后在室温下以 1000 ×g 离心 1 分钟收集细胞沉淀，离心后弃去上清液，将细胞沉淀于 -80 °C 保存。

提取宿主和病毒来源的总DNA和RNA。然后对离心柱进行离心。使用总DNA和特异性针对病毒裂解期转录本的引物进行实时PCR。

通过参考宿主看家基因（如β-肌动蛋白）来确定细胞内gamma HV 68基因组的相对含量。使用总RNA和寡核苷酸dT引物制备cDNA。使用上述cDNA和引物进行实时PCR，以测定病毒转录本的相对含量。

相对于宿主看家基因而言，Mavs 是线粒体抗病毒信号蛋白（mitochondrial antiviral signaling）的缩写，如图所示。Mavs 衔接分子将来自胞质内 RIG-I 样受体的信号进行转导，从而激活 NF-κB 和干扰素调节因子（IRFs），进而上调促炎性细胞因子和干扰素的基因表达。此处显示了 γHV 感染的野生型小鼠及其同窝 Mavs 缺陷型小鼠肺组织中的病毒载量。

Mavs 缺陷在感染后10天显著降低了肺部的病毒载量，表明Mavs是体内高效病毒感染所必需的。该图显示了野生型小鼠胚胎成纤维细胞以及Mavs缺陷型小鼠胚胎成纤维细胞上的病毒多步生长曲线。在Mavs缺陷的细胞中，病毒生长显著延迟，表明Mavs是体外高效病毒复制所必需的。通过实时PCR分析了γHV68感染的小鼠胚胎成纤维细胞中病毒裂解期基因的mRNA水平，结果显示Mavs缺陷显著降低了三个关键裂解期基因的mRNA水平。

上述所有结果共同支持以下结论：Mavs 对于伽马疱疹病毒 68（gamma HV 68）的转录激活及裂解性复制是必需的。观看本视频后，您应能够充分理解如何在体外（VO）和体内（Vevo）多个层面上探究宿主与病原体之间的相互作用。请务必注意，操作病原体时可能存在极高风险。

操作过程中应采取佩戴个人防护装备等预防措施。