利用羟基磷灰石色谱法从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA

本视频演示了一种根据核酸组成分离混合病毒群落的方法。该方法可用于研究复杂病毒群落的分类多样性和功能潜力。此处采用羟基磷灰石（一种结晶态磷酸钙）进行核酸分离。

首先，装填羟基磷灰石柱并进行平衡，然后将纯化的病毒核酸上样至柱中。羟基磷灰石中的带正电钙离子与核酸亚型带负电的磷酸骨架之间的电荷相互作用使核酸结合在柱上。接着，用不同浓度的磷酸盐缓冲液依次洗脱单链DNA、RNA以及双链DNA。所得核酸随后进行脱盐和浓缩，以备通过DNA测序、琼脂糖凝胶电泳进行可视化、定量和鉴定。琼脂糖凝胶电泳结果证实，不同核酸组分可被有效分离，交叉污染低于9%。

因此，该方法能够评估病毒群落的多样性和功能潜力。大家好，我叫Doug Fro，是Shannon Williamson博士在j Craig Venture研究所实验室的一名研究助理。今天我将向大家演示一种从环境病毒群落中分离单链DNA、双链DNA和RNA的实验步骤。

该方法相较于现有方法具有优势，例如针对 DNA 或 RNA 的细胞核处理方法。羟基磷灰石色谱法能够捕获完整的病毒群落。该方法使我们能够回答病毒生态学领域的多个问题。

例如，病毒群落的全部基因组成或多样性如何？当我们希望在不牺牲部分遗传特征的前提下，研究切萨皮克湾整个里约浮游生物群落时，首次想到了这种方法。本实验所需的溶液应按照随附书面方案中的说明提前配制，包括 0.12 摩尔磷酸盐缓冲液、0.20 摩尔磷酸盐缓冲液、0.40 摩尔磷酸盐缓冲液以及 1 摩尔磷酸盐溶液。

所有试剂均需调节至 pH 6.8，并在实验当天使用水合羟基磷灰石；将磷酸盐缓冲液和水合羟基磷灰石置于 60 摄氏度水浴中进行平衡。开始此操作前，先准备用于分离病毒核酸的 Econo 柱。在 Econo 柱末端连接一个旋塞，并确保其处于关闭状态。

使用移液器向柱中加入去离子水，然后盖上柱子顶部的盖子，反复倒置柱子以冲洗。倒掉水，并重复此清洗步骤数次。接下来，从经济柱上取下旋塞阀，并对其进行高压灭菌以达到灭菌目的。

旋塞阀不能进行高压灭菌，因为高温会导致其熔化。用去离子水冲洗旋塞阀，再用70%乙醇冲洗一次，然后在高压灭菌后使其自然晾干。更换旋塞阀并将其关闭。

接下来，在通风橱中操作，向柱子中加入一毫升 Sigma 涂层溶液，并通过如图所示的滚动倒置方式使溶液均匀涂布柱体玻璃表面。使用 Sigma 涂层可最大限度减少核酸粘附于玻璃表面。在分离过程中，盐玻璃表面已进行涂层处理。

打开活塞，将溶液倾入锥形管中。接着，使用两个夹子将层析柱固定在铁架台上，以连接循环水浴。将循环水浴的硅胶管连接至层析柱，使水流方向由下至上。

将温度设置为 60 摄氏度并启动循环。在实际操作中，色谱柱和管路通常会用隔热材料包裹，例如铝箔或泡沫管材隔热层。为减少热量散失，但本步骤在此未予展示。

为了更清楚地观察该操作步骤，关闭旋塞。使用移液器加入 10 毫升无菌无 RNA 酶的水。打开旋塞，使水排尽。

然后按照第二次洗涤步骤再次洗涤。用10毫升无菌无RNAs的0.12摩尔磷酸缓冲液清洗两次，每次洗涤之间倾去液体。此时柱子已准备好进行羟基磷灰石层析。

确保 econ 柱的旋塞阀处于关闭状态。然后使用无菌的 2 毫升血清移液管，缓慢将 2 毫升制备好的重悬再水化羟基磷灰石加入到柱底部。重新盖上柱帽。

让羟基磷灰石在重力作用下沉淀30分钟。该方法需要细致操作。羟基磷灰石柱的流速为每分钟0.25至0.5毫升。

因此，密切观察层析柱以防止其干涸非常重要。30 分钟后，打开活塞，将缓冲液排入废液容器中。关闭活塞，并弃去流出液。

将核酸与0.12摩尔磷酸盐缓冲液混合，终体积为500微升，在60摄氏度孵育10分钟。此步骤可使核酸达到柱子的温度，并通过消除可能存在的任何二级结构，提高不同核酸种类的分离效果。使用2毫升血清学移液管，迅速将核酸溶液加到羟基磷灰石上，注意不要扰动柱体。

当全部500微升液体流经柱子后，可在柱子顶部加入少量0.12摩尔磷酸盐缓冲液，以防止柱子干燥。让核酸与羟基磷灰石结合30分钟。结合孵育结束后，在柱子下方放置一个15毫升锥形管。

然后打开旋塞，收集最初的500微升流出液，其中含有单链DNA。当收集到500微升后，关闭旋塞。接着，向羟基磷灰石中加入6毫升0.12摩尔的磷酸盐缓冲液，注意不要扰动柱体。

然后打开活塞，继续将含有单链DNA的流穿液收集到上一步使用的同一个15毫升离心管中。当收集量达到约6毫升时，关闭活塞。向离心管中加入等体积的苯酚-氯仿-异戊醇溶液，剧烈涡旋混匀，然后在3,500 × g条件下离心15分钟。

离心后，离心管中将出现两层液体。将含有单链 DNA 的上层清液转移至新的 15 毫升离心管中，并将样品在室温下保存，以从层析柱中洗脱并纯化 RNA，加入 6 毫升 0.20 摩尔磷酸缓冲液，并在使用新的 15 毫升离心管前收集穿流液。随后进行苯酚-氯仿抽提。

对于单链DNA样品，使用6毫升0.40摩尔的磷酸盐缓冲液重复此过程，以从柱子中洗脱并纯化双链DNA。最后，为去除柱子中残留的双链DNA，再重复此过程一次。

此次使用6毫升1.00摩尔的磷酸盐缓冲液对核酸样品进行脱盐。将每个样品的4至5毫升转移至配备30,000分子量截断超滤膜的Amicon Ultra-4离心过滤装置中，在30摄氏度下，使用固定角转子以6,000 ×g离心约5分钟，将样品浓缩至少于500微升。弃去滤过液后，将剩余样品全部加入滤膜中。

用无RNAs的1×TE缓冲液将体积调至四到五毫升。然后再次离心，直至获得浓缩体积。离心约五分钟后，向滤膜中加入四到五毫升无RNAs的1×TE缓冲液并进行浓缩。

再次重复上述洗涤步骤，共进行五次，以彻底去除核酸样品中的盐分。待样品完全浓缩并去盐后，将剩余的核酸样品转移至无菌的1.7毫升微量离心管中。通过加入十分之一体积的醋酸钠、两倍体积的100%乙醇以及1微升的GlycoBlue，混匀后充分涡旋震荡，随后离心沉淀核酸。

28,000 ×g，4°C 离心 60 分钟。注意勿扰动沉淀。

加入300微升70%乙醇，在室温下以28,000 ×g离心10分钟，切勿让样品完全干燥，然后将各组分重悬于适当体积的无RNA酶的TE缓冲液中。将等浓度的病毒核酸M13 MP18单链DNA、MS2单链RNA、fI6双链RNA和λ双链DNA混合，随后通过羟基磷灰石色谱法进行分离，如本视频所示。将等浓度的M13 MP18单链DNA、MS2单链RNA、fI6双链RNA和λ双链DNA混合（如第6泳道所示），并上样至羟基磷灰石柱，如图所示。

使用浓度分别为 0.12 摩尔、0.18 摩尔、0.40 摩尔和 1.00 摩尔的磷酸盐缓冲液，从羟基磷灰石柱中分别洗脱单链 DNA-RNA 和双链 DNA。采用 1 KB DNA 标准分子量标记物来确认基因组大小。这些结果表明，该方法能够成功分离单链 DNA、双链 DNA 和 RNA，且各组分之间的交叉污染低于 9%。

该方法还被用于分离切萨皮克湾病毒群落中提取的核酸，如图所示。单链 DNA-RNA 和双链 DNA 分别使用 0.12 摩尔、0.20 摩尔、0.40 摩尔或 1.00 摩尔的磷酸盐缓冲液浓度进行洗脱。第一泳道使用高分子量 DNA 标准 Marker，第二泳道使用 1 KB 标准 Marker，以直观确认核酸的近似分子量和大小，如图所示。从切萨皮克湾浮游病毒中提取的主要核酸类型为双链 DNA。观看本视频后，您应能够充分理解如何利用羟基磷灰石色谱法从混合病毒群落中分离核酸。

这包括羟基磷灰石柱和核酸的制备、利用不同浓度的磷酸盐缓冲液对核酸进行分离与洗脱、脱盐，以及分离后对核酸进行浓缩。