一种简易的Chelex法从按蚊属（Anopheles spp.）中提取DNA

本实验的总体目标是从按蚊标本的中肠和唾液腺组织中提取疟原虫及蚊体DNA。首先在蚊子腹部与胸部连接处精确剪断，从而将中肠与包含唾液腺的部分分离。随后，将各组织部分分别在去离子水中单独研磨处理。

然后裂解组织悬液并进行洗涤，回收细胞沉淀。最后，将细胞沉淀重悬并煮沸，提取DNA。最终可获得高质量的蚊虫和疟原虫DNA，适用于作为模板，通过PCR和等位基因特异性限制性内切酶消化来鉴定异常情况、媒介种类以及疟原虫感染的基因型。

因此，与现有的有机萃取和分选方法相比，这种非常简单技术的主要优势在于其仅需使用少量安全且易得的试剂，并且处理时间也大大缩短。开始解剖蚊子时，将其放置在一小块对苯二甲醛上，并置于解剖显微镜下。用一滴去离子水覆盖样本。

为了减小组织的体积，需在蚊虫尸体的胸部与腹部连接处进行精确切割，从而将头部和胸部从腹部节段分离。将每只蚊虫解剖后的各部分转移至洁净的已灭菌、预先用蚊虫编号和身体部位标记好的1.5毫升微量离心管中，丢弃封口膜，并使用经70%酒精润湿的Kim擦拭布仔细清洁显微镜载物台，然后继续处理下一只蚊虫。提取蚊虫DNA时，首先用移液器向样本管中加入20 µL去离子水。

用移液器吸头将浸没的蚊虫部分研磨成均匀悬液。向样品匀浆中加入100 µL经高压灭菌的1×PBS含1%皂苷溶液，轻轻涡旋混匀。将样品在室温下孵育20分钟。

接下来在20,000 G离心2分钟，弃去上清液。将沉淀重悬于100微升1×PBS中，然后重复离心一次。

加入75微升无菌去离子水和25微升20%（重量/体积）的Cellex 100树脂悬浮液（溶于去离子水中），使用经本生灯火焰灭菌的无菌23号皮下注射针头轻轻涡旋振荡，以重悬沉淀物。在样品管盖上打一个小孔。

将样品悬液在加热块中煮沸10分钟。在20,000 G条件下离心1分钟，然后将DNA溶液转移至预先标记的储存管中，作为PCR反应的模板，用于检测提取DNA的质量，并扩增节肢动物线粒体烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基四基因（mi mitochondrial nicotinamide adenine dinucleotide dehydrogenase subunit four gene）的一个区域，预期产生400个碱基对的片段。接下来，为区分冈比亚按蚊复合种（Ananais Gambia species），扩增位于基因间 Spacer 区域中单核苷酸多态性（SNPs）侧翼的一段区域，预期扩增产物大小分别为：冈比亚按蚊复合种（Ananais Gambia Sens Stricto）390个碱基对，以及Ananais api 315个碱基对。

随后对恶性疟原虫抗叶酸药物耐药相关多态性进行基因分型。通过巢式PCR扩增氨基酸密码子16、51、59、108和164侧翼区域，在寄生虫二氢叶酸还原酶基因中对扩增产物进行等位基因特异性酶切消化，以检测抗叶酸药物耐药性。

相关多态性。在2% AROS凝胶上检测反应结果。对蚊虫DNA提取物质量分析、RABIS分子鉴定以及恶性疟原虫基因分型的PCR检测结果示例显示，尽管简化Kelex法步骤更少，且耗时不足标准盐析法的四分之一，但其所得DNA质量与标准方法相当。因此，基于McNemar卡方检验，针对冈比亚按蚊复合种的样本阳性率以及寄生虫感染率在统计学上无显著差异，这并不令人意外。

在简化型Kelex法和常规盐析法中，向反应体系中添加BSA可通过去除PCR抑制物，普遍提高PCR阳性率。然而，除Kelex提取物的DNA质量外，这种提高在统计学上均不显著。掌握等位基因特异性限制性内切酶消化技术后，可对恶性疟原虫扩增产物进行消化，从而实现蚊虫中肠和唾液腺疟疾感染中耐药等位基因的基因分型。

如果操作得当，该技术应在约37分钟内完成。