利用双光子荧光寿命成像显微技术在小鼠体内可视化蛋白激酶A活性

将一只在运动皮层上方安装了颅窗的麻醉小鼠固定在跑步机上。

小鼠皮层神经元中表达蛋白激酶A报告基因。

将跑步机置于双光子荧光寿命成像显微镜物镜下方。

在物镜和颅窗之间添加一滴水。

让小鼠苏醒并适应跑步机环境。

使用明场照明定位成像区域。关闭显微镜遮光罩以阻隔外部光线。

设置成像参数，启动跑步机旋转以诱导动物运动，并开始成像。

强制运动激活PKA，后者使报告分子发生磷酸化，从而使其供体和受体荧光基团相互靠近。

显微镜将一束红外激光导向样品，激发供体分子将能量转移给受体分子，从而缩短供体的荧光寿命。

当运动停止时，PKA 和报告分子恢复至非活性状态，导致能量转移减少，供体荧光寿命增加。

分析图像以比较静息状态和运动期间皮层内的 PKA 水平。

颅窗植入至少两周后，将双光子激发激光波长设置为 960 纳米，并确认麻醉状态下的实验小鼠对脚趾夹捏无反应。将麻醉后的小鼠置于电动跑轮上，并将小鼠头板固定于跑轮装置的头板固定器中。用 70% 乙醇清洁颅窗盖玻片表面，然后将电动跑轮置于 2pFLIM 物镜下方。

在物镜与颅窗盖玻片之间滴加一滴蒸馏水，让小鼠苏醒，并使其适应 treadmill（跑台）和显微镜环境至少10分钟。在落射照明下定位注射位置，并在明场下记录定位标记特征，以帮助在后续成像过程中对同一兴趣区域进行成像。

关闭落射照明光源。封闭双光子荧光寿命显微镜（2pFLIM）系统的外壳。打开硬件命令电压控制，以激活双光子荧光寿命显微镜的光电倍增管。为获取Z轴层扫的2pFLIM图像，将图像尺寸设置为128×128像素，扫描速度设为每行2毫秒，视场范围设为90至100微米，图像平均帧数设为3帧。

根据样品制备情况和硬件配置调整成像参数。在FLIM视图中检查所获取的图像。可通过减小视场、降低扫描速度、增加激光功率以及增加平均帧数，以提高总光子计数并按需减少寿命估算误差。

务必确保每个感兴趣区域获得足够的光子数。视野中一个阳性胞体可接受的累积光子计数约为 1,000 至 10,000 个光子。

当图像优化完成后，在跑步机速度为0的条件下，以固定时间间隔采集至少15分钟的基线重复Z层扫描图像。随后将跑步机转速设置为约厘米/秒，持续15分钟，同时采集双光子荧光寿命成像（2pFLIM）图像，接着在关闭跑步机转动后继续采集图像至少20分钟，以评估强制运动停止后蛋白激酶A活性持续的时间。

进行双光子荧光寿命成像（2pFLIM）图像分析时，在film视图中打开图像，点击单光子计数最小值和最大值范围输入框，输入适当的单光子计数范围的最小值和最大值。点击时间0值输入框，输入时间0的数值；点击寿命亮度最小阈值输入框，输入介于5至30个光子之间的所需阈值。

点击“新建组”按钮，并为实验组命名，以创建一个整合所有添加的FLIM图像数据的组。在“感兴趣区域”控制模块中点击“感兴趣区域”，并在T-ACCR alpha阳性胞体周围绘制感兴趣区域。移动Z层扫描控制滑块中的下限和上限Z值，以缩小Z层扫描范围，减少来自背景光子和其他Z层面信号的干扰，然后点击“添加”将该FLIM图像加入组中。

单击 calc 以计算感兴趣区域的寿命估计误差中的平均寿命，并打开 2pFLIM 成像序列中的下一个文件。在每幅连续的图像中测量同一 T-ACCR alpha 阳性胞体，根据需要调整围绕胞体的感兴趣区域。当所有图像分析完成后，在组控模块中选择 delta 平均光子发射时间 delta mean photoemission T0，然后单击基线数值字段，输入感兴趣图像的索引，以定义用于计算基线寿命的图像。

然后，单击绘图以生成一张图表，该图表包含实验过程中在定义的兴趣区域内T-ACCRα阳性活性的荧光寿命成像（FLIM）响应，从而实现对蛋白激酶A在激酶穿越不同兴趣区域时的活性进行比较。