通过比率型FRET监测细胞周期中的激酶与磷酸酶活性

在本视频中，通过荧光共振能量转移（FRET）技术监测整个细胞周期中的激酶和磷酸酶活性。此处使用的类似Polo激酶1（PLK1）活性探针，其一端带有青色荧光蛋白（CFP），另一端带有黄色荧光蛋白（YFP）。该探针被转染至U2 OS细胞中。

接着，为了检测LK在G2/M期转换过程中作用靶点的磷酸化状态，对转染的U2 OS细胞进行延时荧光成像。当CFP与YFP彼此靠近且CFP被激发时，能量会转移至YFP，从而可检测到YFP的发射信号。然而，当探针发生磷酸化后，蛋白质构象发生变化，导致CFP与YFP相互分离。

现在当CFP被激发时，可检测到强烈的CFP发射信号，而YFP发射信号仅很微弱。通过定量分析在CFP和YFP激发后YFP发射信号的比值，结果表明PLK1的活性在G2期增加，并在有丝分裂期间达到峰值。因此，与现有的标准延时成像等方法相比，该技术的主要优势在于特别关注确保细胞周期不会因成像条件或探针表达而受到干扰。该方法有助于回答细胞周期研究领域中的关键问题，例如特定激酶或磷酸酶在何时何地被激活。

尽管该方法可用于研究细胞周期调控的酶，但也适用于其他需要未标记条件的系统，例如细胞增殖检测。为了监测人类细胞周期，使用基于FRET的PKA活性探针转染U2 OS细胞。采用标准的磷酸钙转染方法，并用嘌呤霉素对细胞进行至少七天的筛选。

这可以富集表达探针的细胞群体，并减少表达水平具有毒性或严重干扰细胞周期的细胞数量。随后通过有限稀释法筛选稳定克隆，再检测CFP和YFP的表达，以确认它们在所有细胞中均以大致相同的比例存在。如果部分细胞仅含有CFP或YFP，则很可能发生了重组；此时应使用同源重组倾向较低的菌株（如Sure2细胞）重复质粒制备，然后将质粒线性化并重复转染实验。

待细胞稳定表达探针后，将其接种于1.5号玻璃底培养皿中，待细胞贴壁且融合度达到30%至50%时进行实验。更换为不含酚红且不依赖CO2的培养基，将培养皿置于带有温度控制（设定为37摄氏度）的电动倒置荧光显微镜上。显微镜需配备CFP和YFP的激发与发射滤光片。

选择适用于监测CFP和YFP的ROIC物镜，以及满足所需分辨率的物镜。此处使用20倍、数值孔径（NA）0.75的空气物镜。利用透射光将细胞调至焦点。

此时请勿使用荧光光源，因为它会诱导产生应激反应，可能干扰细胞周期。为避免光毒性，应将光强调节至可实现所需亚细胞分辨率的最高允许值。在本实验中，应能够区分细胞核与细胞质。

设置较短的曝光时间并插入高密度中性滤光片。然后使用YFP激发和发射条件采集12位或16位测试图像，调整曝光时间及中性密度滤光片，使细胞内的平均强度约等于背景强度加上五倍的最小与最大背景强度之差。为验证图像未发生饱和，请检查样品图像的荧光强度。

图像中的最大强度应小于动态范围的一半，以便在细胞进入有丝分裂时能够分辨强度差异。接下来，使用CFP激发和YFP发射滤光片重复此过程。选择多个转染细胞区域，但需排除用于对焦和优化曝光条件的区域。

由于这些操作可能引发应激反应，需确保所有细胞中的信号最大强度低于动态范围的一半。设置软件每45分钟采集两次图像，使用YFP激发、YFP发射和CFP激发滤光片进行YFP发射检测。

同时将实验的总时长设置为超过细胞周期的持续时间。一切设置完成后，开始采集图像。采集完成后，打开所获得的图像，并监测从一次有丝分裂到下一次有丝分裂的细胞周期时间。对于此处表达转染探针的细胞，细胞周期时间大约为20至25小时。

将此结果与所用细胞类型的对照数据进行比较。如果细胞周期时间与参考时间相符，则可对FRET进行分析。确认时间参数无误后，即可对图像进行分析。

该分析可由大多数专用于显微镜的软件完成。此处使用 ImageJ 免费软件配合 Ratio Plus 插件进行分析。首先在 ImageJ 中打开图像以开始分析。如果图像是多色堆栈格式，可通过选择“图像”并将其转换为超堆栈来分离各个通道。

然后选择超堆栈，再将堆栈转换为超堆栈。此时会打开“转换为超堆栈”窗口，显示相关设置，单击“确定”。图像下方将显示两个滑动条。

接下来，将图像拆分为单通道图像栈，点击图像并选择“hyper stack reduce dimensionality”（超维图像栈降维）。这将打开降维窗口，请确保已选中“frames”（帧）和“keep source”（保留源）选项，然后点击“Okay”（确定）。

将出现一个仅包含单个通道的新图像。重复此过程以调出包含第二个通道的新图像。接下来，为了提高最终图像的视觉清晰度，选择YFP激发YFP发射图像栈。

单击“process”，然后单击“math”。接着选择乘法操作，当乘法窗口打开后，输入数值三，将YFP激发-YFP发射图像栈乘以三。此步骤为可选，目的是确保比值结果不在零到一之间。

接下来，在图像 J 工具栏上选择自由手绘工具。然后在 YFP 激发、YFP 发射图像栈中，选择一个无细胞但靠近待测细胞的区域绘制感兴趣区域（ROI）。要将该 ROI 添加到 ROI 管理器，请点击分析工具，然后选择 ROI 管理器。

ROI 管理器窗口将出现。单击“添加”以保存 ROI 坐标，用于测量 YFP 激发-YFP 发射图像堆栈中 ROI 的平均强度。单击“分析”，然后选择“测量”。

结果窗口将打开。选择CFP激发、YFP发射的图像序列，然后在ROI管理器中双击该ROI，并重复测量。

测量结果将添加到结果窗口中。滚动至堆栈中的其他位置，以在多个时间点重复此过程。通过比较结果窗口中的测量值，确认在整个影片中靠近目标细胞的背景强度相似。

若要设置包含最小强度的测量参数，请点击“analyze”，然后点击“set measurements”并指定最小和最大灰度值。随后将显示一个包含测量选项的窗口。根据需要调整亮度和对比度后，绘制一个覆盖大部分细胞的感兴趣区域（ROI），并在两个图像栈中测量最小强度。

然后使用样品池代替背景进行与之前相同的测量。根据结果部分的数值，计算测得的最小强度与背景强度之间的差值，并将该差值除以二。由此可得到一个初始的剪切值，用于设定开启动作比及选择插件。

然后计算比率值。对于FRET比率，选择CFP激发、YFP发射的S堆栈一；或对于在磷酸化后FRET效率降低的探针，选择YFP激发、YFP发射的S堆栈一，并输入测得的背景强度和裁剪值。

使用结果窗口中的数值，将其粘贴到比率加窗口中。设置生成的比率图像堆栈的缩放比例，并应用合适的查找表以可视化比率变化。表达基于FRET的探针监测PLK1活性的U2 OS细胞，按照本视频所述方法进行了60小时的拍摄。

该图像显示了50个表达FRET探针的细胞的累积有丝分裂进入情况，包括子细胞的分裂。大多数表达该探针的细胞增殖周期时间为20至25小时，表明成像条件和探针表达水平不影响细胞周期时程。通过一个细胞连续四次分裂过程的倒置FRET比率的伪彩图显示，尽管存在较大噪声，但仍可观察到PKC1活性在G2期上升，并在有丝分裂期间达到峰值的趋势。

当原始数据经过均值滤波并以图形形式呈现时，活动峰之间的时间易于估算。该图显示了从上一幅图像中的细胞所绘制的倒置FRET比率的量化结果。可以估算出激活的时间，如图所示，探针的磷酸化在有丝分裂中磷酸化达到峰值前约四小时即已开始显现。

在进行该实验操作时，重要的是要使细胞保持在无应激状态，因此需尽量减少光照暴露，并避免温度或pH值的变化。还需注意，该方法用于监测细胞内激酶与磷酸酶活性之间的平衡。该实验流程可与RNA干扰或抑制剂筛选相结合，以鉴定这些激酶和磷酸酶的上游调控因子。