分离 & Hoechst 染料的表征^低 CD45^阴性 小鼠肺间充质干细胞

本视频演示了一种分离宿主低 CD45 阴性肺间充质干细胞的实验方案。组织驻留间充质干细胞（MSCs）是组织修复或再生、纤维化、炎症以及血管生成的重要调控细胞。首先，从处死的小鼠中解剖取出肺组织。

肺组织经消化处理以获得单细胞悬液。细胞使用鬼笔环肽（hoax dye）和CD45进行染色，并通过流式细胞术分选，以获得宿主CD45阴性的肺间充质干细胞（MSCs）。随后在体外培养扩增肺MSCs，并进行集落形成实验，以评估MSC的分化能力。

随后可开展进一步研究，以探讨间充质干细胞（MSCs）在组织稳态及疾病中的作用。本文所示方法可用于分离小鼠或人肺来源的间充质干细胞，并可应用于肺纤维化、肺动脉高压和慢性阻塞性肺疾病（COPD）等肺部疾病的研究。通常，初次接触该方法的研究者可能会面临困难，原因在于组织制备方法多样，且流式细胞仪的设置、适当对照的建立以及数据分析均具有挑战性。

由于仅用文字难以准确描述用于获取高细胞活力的肺组织的切碎与消化的正确技术，因此本方法的可视化演示至关重要。此外，流式细胞仪的仪器设置与数据分析也以演示方式传达最为有效。本实验方案首先取出已处死的成年小鼠用于获取间充质干细胞的肺组织。

使用一把小型锋利的剪刀，在小鼠两侧肋骨外侧横向剪开肋骨。打开胸腔，然后移除膈肌。将一支10毫升注射器（配20.5号针头）插入右心室，轻轻推动针栓，用3至5毫升磷酸盐缓冲液（PBS）灌注，以冲洗肺部中的血液。

接下来，使用剪刀剪断气管和大的支气管并弃去。然后用镊子夹起白色的小肺叶，放入盛有Hank's平衡盐溶液（Hank's buffered saline）或HBSS的培养皿中。

然后取出心脏并分离肺叶。对研究中的所有小鼠重复此操作。将肺叶转移至培养皿的盖子中。

用适量的HBSS润湿组织，以防止其干燥。然后使用一次性手术刀切碎肺叶，以获得骨髓，用于流式细胞术的维持对照。使用一把锋利的剪刀在股骨的踝关节和顶端处进行剪切。

将肢体放入一个新的培养皿中。然后切除膝关节，保留一段股骨，以及另一段包含胫骨和腓骨的组织。使用镊子剥离肌肉，暴露出胫骨、腓骨和股骨。

现在取一个5 mL注射器，配26½号针头，将针头插入骨髓腔开口处。握住胫骨的一端，使另一端朝向一个装有15 mL HBSS的50 mL锥形管，推动注射器活塞，注入HBSS以冲洗骨髓至管中。用腓骨和股骨重复此操作。

用终浓度为每毫升五微克的宿主3 3 3 4 2染料，在添加了高糖的DMEM中对骨髓进行染色。接下来，将从分离的肺组织制备单细胞悬液。将每份肺组织置于含有预热的0.2% Worthington的离心管中。

在无菌 HBSS 中配制 II 型胶原酶，然后将试管浸入 37 °C 水浴中孵育 30 分钟。孵育结束后，用 10 毫升移液管反复吹打样本，直至消化液能顺畅通过移液管。重复吹打约 10 次后，于 37 °C 再继续孵育 15 分钟，以完成组织消化。

消化完成后，用HBSS稀释细胞悬液，并使用5毫升移液管再次反复吹打以分散任何残留的组织碎片。接下来，为去除未消化的组织碎片，将悬液通过70 µm细胞滤网倒入50 mL锥形管中。每次加入少量悬液，以便样品顺利通过细胞滤网。

如果未消化的组织碎片完全阻塞了细胞悬液的流动，将其倒入新的细胞滤网中，过滤至新的离心管内。在450 RCF条件下离心10分钟，收集细胞沉淀。

离心后，弃去上清液，并在室温下用红细胞裂解缓冲液轻轻重悬细胞沉淀，室温孵育5分钟。然后加入等体积的HBSS以中和裂解缓冲液。

将细胞悬液倒入40微米细胞滤器中，以去除碎片和细胞聚集体，并用新的50毫升锥形管收集滤过液。接着，使用血细胞计数板对肺和骨髓样本的细胞数量进行测定。记录细胞悬液的浓度及总体积。

然后以450 RCF离心10分钟，沉淀单肺细胞悬液。为维持细胞活性，需同时重悬肺组织和骨髓细胞，以每毫升含10⁶个细胞的浓度置于预温的高糖DMEM完全培养基中。

为了染色DNA，将HOAXED 3 3 3 4 2染料加入至终浓度为每升5微克。接着，通过轻柔颠倒混匀细胞，并在37摄氏度水浴中准确孵育90分钟。孵育结束后，在4摄氏度条件下以450 ×g离心10分钟。

使用抗CD45抗体和碘化丙啶对肺组织和骨髓组织进行染色，为流式细胞术分析做准备。细胞染色完成后，将样品管置于冰上避光保存，直至进行流式细胞术分析。进行流式细胞术前，需确保仪器激光已校准，并已设置为细胞分选模式。

所使用的仪器必须配备蓝色488纳米、红色635纳米以及紫外350至355纳米激光器，并在紫外激光光路中配置两个检测器，分别带有蓝色45/65和红色675/50滤光片。此外，紫外-红色检测器必须对红色信号具有高灵敏度，且仪器须配备制冷装置，以将样品温度维持在10摄氏度。在仪器软件中，设置直方图以显示线性前向散射与侧向散射的关系，以及适用于该仪器的双联体 discrimination 图。

使用对数信号的 PI 直方图，使用线性信号的红色对蓝色散点图，以及使用对数信号的 CD45 APC 直方图。仪器准备就绪后，将染色的骨髓样本放入仪器的上样口。该样本用作染色和仪器设置的对照。

开始采集事件并调整前向散射的线性信号。为了清晰地观察细胞群体，细胞应大致位于以散射光为x轴的散点图的下中心区域。由于核染料PI具有膜不通透性，因此会被活细胞排除在外。

在PI直方图中PI阳性死细胞上绘制一个门控区域。指示仪器软件对死细胞进行着色，在此门控中将其设为红色。

使用颜色标记的死细胞作为导航工具，有助于识别宿主的G₀/G₁期细胞群。PI染色也可被紫外激光激发，大多数死细胞的信号应超出量程。在红色与蓝色鬼红荧光散点图的右侧，骨髓细胞的G₀/G₁期细胞群应在红色与蓝色鬼红荧光图中呈现为一个紧密的事件聚集簇。

调节检测器电压，使细胞周期的G零G一期细胞簇位于图中右上方中央位置。S期的一部分以及整个G二期可能超出量程。在红色对蓝色的假象图右上方，可见侧群细胞（side population）的低信号从G零G一期细胞簇的左侧向下延伸至图的左下角。

现在在FSC与SSC图中对细胞簇绘制门控。绘制在双峰图中识别出的单细胞群体以及PI直方图中的活细胞。然后设置伪图仅显示这些已设门的群体。

在圈选宿主细胞群后，围绕侧群细胞绘制一个区域。将此区域作为门控设在CD45 APC直方图上，并结合光散射单细胞门和活细胞门。系统设置完成后，从上样口取出样本，将肺组织样本放入上样口。

该样本无需再次调整仪器设置。开始在红色与蓝色假象图上收集事件。肺组织样本的G零G一簇通常在x轴方向上显得更为细长，类似于键盘上的波浪符（~）。

侧群细胞的门控位置应与骨髓样本设定的位置相似。可能需要进行微调上下位置，以确保侧群细胞得到清晰的分辨。分选过程中应保持较低的压力差，确保样品流速阀门不要开启过大。

接下来，为了分离间充质干细胞（MSC），将一个96孔收集板放入分选室中，并在CD45 APC直方图上设置分选门，以区分阳性与阴性细胞群。最后，将细胞收集为混合细胞群至离心管中，或以单细胞方式收集至96孔板中用于克隆分离。在通过细胞分选获得肺部MSC后，将细胞接种于30毫米培养皿中，使用添加20%胎牛血清（FBS）的α-MEM培养基进行培养。首先，分选后的细胞在培养约两到三周后呈现体积小、圆形且折光性强的形态。

具有间充质表型的克隆变得明显，且每种细胞制备物的增殖更为显著。评估肺部间充质干细胞（MSC）向成骨细胞、脂肪细胞和软骨细胞等传统间充质谱系分化的能力，以及其对公认间充质标志物的细胞表面表达。进行细胞遗传学核型分析，以确认不存在明显的染色体异常。

通过流式细胞术分离并获得单细胞克隆后，进行集落形成实验以表征间充质干细胞（MSC）及其分化能力。实验起始时，将细胞稀释至每毫升3 × 10⁴个细胞。在100毫米培养皿中加入不完全培养基，进行系列稀释，分别为每皿2 × 6 × 10⁴、3 × 10⁴、1.5 × 10⁴和0.75 × 10⁴个细胞，每种条件设三个重复，每皿加入10毫升培养基。

培养10天后，将培养板放入培养箱中，倒掉培养基，并用PBS冲洗细胞。然后在室温下加入100%甲醇固定5分钟。5分钟后，倒掉甲醇。

然后，为了检测集落形成，将0.4%（重量/体积）的gza用去离子水按1:20稀释后加入，孵育10至15分钟。随后倒去染色液，用去离子水冲洗。让样品自然风干，并使用倒置显微镜或可视化方法对每个集落中细胞数超过25个的集落进行计数。

菌落较大，由数百个细胞组成，如图所示，并呈现间充质样表型。间充质干细胞（MSC）的分离方法如本视频所示，并接种于96孔板中进行模拟生长。随后将CFSE标记并处于生长阻滞状态的抗原呈递细胞加入肺来源的MSC中。

通过比较CFSE平均荧光强度相对于背景的下降程度来测定分离的MSCs的增殖情况，其中背景为仅标记CFSE的T细胞（如本图所示），在无肺部干细胞、但存在抗原呈递细胞的情况下，A PC加减O型白蛋白CD40阳性效应T细胞显示出CFSE荧光强度降低（以红色圈出），表明发生了增殖。T细胞膜上的CFSE荧光强度在每次细胞分裂时均等减半；在存在肺部M-S-C-A-P-C加减OVA的情况下，CD40阳性效应T细胞的CFSE荧光强度未发生显著变化，表明缺乏增殖。该技术为肺干细胞生物学领域的研究人员探索间充质干细胞在肺动脉高压和肺纤维化等肺部疾病中的作用奠定了基础。

掌握此技术后，按照本方案操作，大约可在五小时内完成。还可进行其他方法，如分化检测，以回答更多问题，包括推测的肺间充质干细胞是否具有向骨、脂肪和软骨等多谱系分化的潜能。