小鼠原代肾小管上皮细胞的分离、鉴定及高通量细胞外通量分析

该方法有助于解答有关肾脏代谢的关键问题，例如脂肪酸氧化，其与肾纤维化及多种其他肾病的发生密切相关。该技术的主要优势在于利用高通量平台筛选能够调节肾小管上皮细胞线粒体生物能量的化合物。该技术的应用前景延伸至肾脏代谢性疾病的治疗，因为它能够对调节肾上皮细胞线粒体代谢的化合物进行高通量筛选。

为制备胶原包被的60毫米培养皿，向每个培养皿中加入2毫升预过滤的20毫摩尔醋酸溶液，随后加入35微升I型胶原溶液。然后在室温下孵育1小时，风干，并进行紫外照射。接着用PBS冲洗去除醋酸残留，重复冲洗三次。

然后，将培养皿置于37摄氏度、无二氧化碳的细胞培养箱中。在准备小鼠手术时，使用脱毛膏去除胸部和腹部的毛发。接着，用碘液对皮肤进行消毒，并擦去残留的碘液。

接下来，切开腹腔以暴露心脏和肾脏。然后，将灌注泵设置为每分钟32毫升，并在开始灌注前清除管路中的所有气泡。在管路末端使用27号针头。

操作时，将针头从心脏心尖处插入左心室。当灌注缓冲液充满心脏后，立即在右心房上刺一个小孔，以提供灌注缓冲液的流出通道。随后，切换为消化缓冲液，并将泵速略微调低至每分钟30毫升，以进行消化。

灌注20毫升消化缓冲液后，取出双侧肾脏用于肾小管细胞的分离。处理收获的肾脏时，首先去除肾包膜和髓质。然后将双侧肾脏切成微小碎片，加入10毫升消化缓冲液，在37摄氏度摇床中孵育5分钟。

消化完成后，将缓冲液通过70微米滤膜以去除未消化的组织。收集消化后的组织后，加入10毫升培养基以终止消化反应。接着，将滤过的组织悬液在50 ×g下离心5分钟，使肾小管细胞沉淀。

然后，将上清液转移至新管中，加入5 mL培养基，并重复离心以收集残留的管状细胞。接着，将第一次获得的沉淀重悬于20 mL培养基中，在50 ×g条件下离心5分钟，以进一步纯化收集的细胞。弃去上清液。

然后，将两个沉淀均重悬于10毫升培养基中。接着，使用台盼蓝染色法计数活细胞。随后，将最多1000万个细胞接种至60毫米的胶原蛋白包被培养皿中，静置过夜使管状细胞贴壁。

首先，将 P1 小管细胞以每孔 40,000 个细胞的密度接种至新制备的、经胶原蛋白包被的 96 孔微孔板中。每孔加入 100 µL 培养基。在细胞外通量检测中，细胞密度和化合物浓度的优化是实验成功的关键。

我们建议先进行预实验以确定最佳的细胞密度和化合物浓度。接下来，水合传感器 cartridge。首先，抬起传感器 cartridge，向每孔中加入 200 µL 校准液。

然后，重新放置 cartridge 以浸没传感器，并在 37 摄氏度下孵育装置过夜。第二天，吸除旧的培养基，加入 175 µL 葡萄糖或脂肪酸检测试剂。随后，在无二氧化碳条件下继续孵育 1 小时。

在细胞孵育过程中，向微孔板的A孔加入25微升寡霉素，B孔加入FCCP，C孔加入鱼藤酮/抗霉素A，D孔及所有其他孔加入水。随后，将微孔板置于无二氧化碳的孵箱中，直至仪器准备就绪进行校准。接着，打开细胞外通量分析仪和控制器。

接下来，打开分析软件，选择一个标准检测方法，然后点击“检测向导”选项。接着，在“化合物”选项卡下，将化合物分配至相应的端口。在“背景校正”选项卡下，选择不含细胞的孔。

接下来，使用“分组与标签”选项卡为实验组别添加标签。然后，在“实验方案”选项卡下，利用可用命令设置适当的混匀和检测循环次数。这些设置在文本版实验方案中已有说明，输入完成后，请保存该模板以供将来使用。

现在，按“结束向导”继续。然后，按“开始”以启动校准。分析仪将弹出板架，并提示插入盒式板。

此校准过程需要 20 至 25 分钟才能完成。系统校准后，按下提示命令，将校准板更换为细胞板，然后继续运行。运行完成后，保存 OCR 数据，并从分析仪中取出板。

现在，向每个检测孔中加入 Hoechst 染料，在 37 摄氏度下孵育 5 分钟。然后使用 355 纳米激发光和 460 纳米发射光检测细胞数量，并将 OCR 数据归一化至细胞数。在本方案中，将包含异质性肾细胞、未完全消化的小管以及其他组织碎片的混合物接种于胶原包被的培养板上进行培养。

分离后的第二天，将培养基离心以去除碎片，并将小管细胞重新接种。随后，细胞更易贴壁，培养至第五天时，细胞融合度达到80%至90%。然后对肾小管上皮细胞进行传代培养，一周内即可生长至融合。

在随后的两次传代中也观察到类似的生长情况。细胞单层形成穹顶状结构，从培养板上隆起，并通过紧密连接保持附着。采用已描述的细胞外通量分析法，在不同接种密度下测定分离得到的原代胸腺上皮细胞（TECs）的线粒体呼吸耗氧率（OCR）。

细胞接种密度越高，OCR 值也相应增加。每孔接种 40,000 个细胞时，细胞对培养板表面的覆盖效果优于其他任何接种密度，因此是检测细胞与化合物相互作用的最佳浓度。例如，在传代一至二代的 TEC 中加入含脂肪酸底物的培养基以及糖酵解抑制剂 2DG，可直接评估 TEC 中的脂肪酸氧化情况。

在进行该实验操作时，务必准确记录每个孔中的精确体积和浓度。组分的最终浓度发生变化可能导致整个实验失败。该技术建立后，将为肾脏病学领域的研究人员探索肾小管脂肪酸代谢在多种肾病发病机制中的作用提供新的途径。