为什么全内反射荧光显微镜能提高神经元胞吐研究中的靶点验证效果？

全内反射荧光显微镜（TIRF）可选择性地激发靠近质膜的荧光分子，从而直接观察囊泡融合事件。这有助于揭示调控胞吐作用的靶点机制，并支持在与疾病相关的神经元模型中进行功能验证。

将质膜分离作为成像平面如何支持发现流程的目标？

通过将激发光限制在隐逝波范围内，TIRF 可以分离出靠近细胞膜的事件，降低细胞质背景信号。这提高了对外排过程检测的特异性，使得在早期发现工作流程中获得更清晰的读出结果。

延时TIRF成像可为胞吐作用分析提供哪些定量测量？

在TIRF条件下进行延时成像，可测量胞吐事件的频率、时间进程和空间分布。这些定量结果可用于动力学分析，并支持在筛选实验中评估化合物的作用效果。

为什么在基于成像的检测中，重复实验和参数标准化对于跨职能协作至关重要？

一致的成像参数和重复实验可确保不同用户和实验之间的数据可靠性和可比性。这有助于在多团队参与的科研项目中实现标准化检测方法的应用。

在实施之前，解读TIRF衍生的胞吐数据需要哪些统计分析能力？

团队需要具备使用适当的统计检验方法分析事件频率、时间和分布的能力。这能够基于数据对神经元模型中的靶点调节或化合物效应做出决策。

全内反射荧光显微镜用于胞吐事件的可视化

JoVE Encyclopedia of Experiments

神经科学

0 次观看 • 3:54 分钟 • June 17th, 2025

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将接种有胚胎皮层神经元的玻璃底培养皿置于全内反射荧光（TIRF）显微镜载物台上开始实验。

这些神经元表达一种 pH 敏感的绿色荧光蛋白，或表达一种 GFP 标记的囊泡标记物，该标记物在中性细胞外 pH 条件下发出荧光，但在酸性囊泡中则不产生荧光。

囊泡与质膜融合后，暴露于细胞外pH环境会诱导荧光产生，从而标记出胞吐事件。

选择物镜，并将折射率调整至与神经元匹配。

将激光束以一定角度照射到玻璃上，从而产生全内反射并生成隐逝波。该隐逝波可选择性地激发靠近质膜的GFP标记物。

调整TIRF的穿透深度，以排除在渐逝场上方的GFP标记物。

首先，使用宽场落射荧光照明定位表达 GFP 的神经元。

然后，切换至TIRF照明，以实现膜特异性激发。

获取时间序列图像，以记录囊泡融合事件并可视化胞吐作用。

根据文本方案设置好TIRF显微镜和样品，并找到神经元的焦平面后，启动激光器软件并连接至激光控制软件。将照明模式设为宽场，并选择物镜。然后设置样品的折射率，并通过取消勾选491激光器的TTL来调节激光强度。

在对完整胞吐囊泡进行成像时，优化成像参数至关重要，以避免焦点漂移和光毒性，同时获得足够用于分析的高信噪比图像。

将滑块调节至100，然后将其回调至20到40之间的数值。随后重新检查TTL。接下来，再次使用透射光照明对样品进行聚焦。

然后在成像软件中选择 491 激光照明，并打开快门。将聚光镜倒置放置在光学平台上，以免划伤镜头。微调激光在天花板上的焦点位置。

移除聚光镜后，将光点对准闭合的视场光阑中心。然后重新安装聚光镜。在TIRF软件中，将穿透深度设置为110纳米。随后将照明模式从宽场照明切换至TIRF照明模式进行成像。

现在，使用宽场落射荧光法，通过目镜寻找表达 VAMP2 florin 的细胞。随后，为减少光漂白和光毒性，调整成像参数，以最短的曝光时间和最低的激光强度来最大化信噪比和动态范围。为每个细胞设置连续自动对焦。然后以每 0.5 秒采集一次的频率，连续采集 5 分钟的时间序列图像。