同时干涉反射与全内反射荧光显微镜技术用于成像动态微管及其相关蛋白

该方法的意义在于，它能够以高帧率同时对无标记的微管和荧光标记的蛋白质进行成像。该技术的主要优势在于其实现简便，且对光学组件的要求极低。此外，该方法避免了对微管进行氟-4标记的需要。

首先，按1:10的质量比将固化剂与基础弹性体混合，制备PDMS聚合物。混合两分钟，然后将混合物置于真空腔中脱气，直至所有气泡消失。随后，将混合物倾倒至主模具上，形成约0.5厘米厚的层，注意避免产生气泡，并将混合物放入预热至70摄氏度的烘箱中加热40分钟。

然后，切下聚合物的结构区域，并使用PDMS打孔器在通道两端打孔。接着，清洗PDMS块的结构面。随后，依次用异丙醇和甲醇各冲洗三次，再用超纯水冲洗，最后吹干表面。

接下来，使用氧气或空气等离子体对PDMS进行等离子清洗，并将清洗后的PDMS置于适当清洁的盖玻片上。在80摄氏度的加热板上加热15分钟。将合适尺寸的低密度聚乙烯管插入孔中，并将出口管连接至0.5毫升的注射器。

然后，将进样管浸入溶液中，用注射器吸取所需体积的溶液，使溶液流入微通道。将样品置于显微镜载物台上，打开落射式照明光源以进行反射干涉显微成像。调节显微镜焦平面时，应在PDMS与溶液界面附近寻找合适的焦平面，并选择靠近通道中心的视野进行观察。

接下来，用 BRB80 配制 0.1 微摩尔的荧光微球溶液，并至少注入一个微流控通道体积的微球溶液。通过 IRM 或 TIRF 监测反应过程。当微球达到理想密度时，用 BRB80 洗去多余的微球。

将稀释后的种子流入反应室，并通过IRM监测反应过程。当种子密度达到预期时，用BRB80洗去多余成分。接着，配制微管延伸混合液，其中包含12微摩尔未标记微管蛋白、1毫摩尔GTP、5毫摩尔DTT的BRB80缓冲液。

然后，在确保反应温度为 28 摄氏度的条件下，流入至少一个通道体积的延伸反应混合液。首先，在显微镜软件中设置成像参数。开始成像，并将驱动蛋白溶液流入样品腔室。

然后，观察标记有GFP的驱动蛋白1所结合的微管去解聚现象。测量完成后，录制一段短视频，期间缓慢地以圆形或横向移动载物台。该视频的中值投影将用作背景图像，并从原始测量数据中减去。

在 ImageJ 中，通过单击“Image”从背景记录创建中值投影。然后，选择“Stacks”选项，再单击“Z Project”。接下来，通过单击“Process”，然后选择“Image Calculator”选项，将中值背景投影从原始图像数据中减去，同时确保勾选 32 位浮点结果选项。

进行图像配准时，选择靠近目标微管的一组微珠，并利用它们对TIRF和IRM图像进行对齐。对于该组中的每个微珠，使用多点选择工具在TIRF通道中标记其大致位置，然后在IRM通道中标记相应的位置。随后，运行提供的ImageJ宏程序。

微珠在右侧的IRM通道中呈现为暗斑，而在左侧的TIRF通道中呈现为亮斑。通过定位部分微珠，校准程序可正确地将两个通道图像叠加。采用本方案还获得了EGFP标记的驱动蛋白分子向微管缩短端行走的显微动态图像（kymograph）。

进行此操作时，选择高数值孔径的物镜非常重要，以实现全内反射，并最大限度地提高信号收集效率和图像对比度。该方法可用于对单个荧光分子进行高分辨率成像，同时观察那些尺寸足够大、可通过干涉反射显微技术（IRM）可视化的超分子结构，例如细胞膜或肌动蛋白丝。本实验方案还提供了一种易于调整的流程，可实现干涉反射显微（IRM）、全内反射荧光显微（TIRF）和落射荧光显微的任意组合同步成像。