切割加载：检测视网膜神经元间缝隙连接示踪剂耦合程度的有效工具

以下剪切加载实验的总体目标是在受控光照条件下，检测完整视网膜中神经元之间通过缝隙连接进行示踪剂偶联的程度。第一步是使用浸有神经生物素溶液的锋利刀片切割视网膜，神经生物素是一种示踪分子，可扩散通过开放的缝隙连接通道，但不能穿过细胞膜。第二步是将视网膜在任氏液中孵育，以允许示踪分子通过开放的缝隙连接通道扩散。

如果缝隙连接耦合较弱，神经生物素荧光将局限于靠近切口的视网膜神经元。相反，如果缝隙连接耦合较强，则可在远离切口的视网膜神经元中检测到荧光。与现有技术相比，切口加载法的主要优势在于其更易于在具有小胞体的完整神经视网膜组织中的神经元上进行操作。

在进行切割加载时，控制照明条件也比在完整视网膜组织中对单个神经元进行电生理研究时更容易。因为在电记录过程中使用的光刺激本身可能导致缝隙连接耦合发生变化，因此本技术的演示将由我实验室的博士后 Chu Choi 博士完成。在此操作中，实验前至少一小时将金鱼置于持续黑暗环境中，并在白天持续黑暗条件下完成后续所有步骤，直至视网膜组织被固定。通过向水族箱水中添加 150 毫克/升甲磺酸三卡因，对金鱼进行深度麻醉。

然后根据联邦和大学的指导原则处死金鱼，并小心摘除其眼球。接着，切除每个眼球的前部。随后，将一片滤纸放在眼球后部的上方，然后将滤纸和眼球倒置，使滤纸位于眼球后部的下方。

现在，从经暗适应的金鱼眼中轻柔地去除眼球后部，包括巩膜和色素上皮。用精细剪刀剪断视神经。在完整神经视网膜从眼球后部解剖分离后，将金鱼神经视网膜感光细胞面朝上固定于滤纸片上，随后将其放入六孔板的各孔中，每孔加入5毫升经碳酸盐缓冲的含氧林格氏液，可选择性添加待测药物，此时金鱼仍处于麻醉状态。

在持续黑暗条件下将视网膜转移至孔板中。随后用对苯二甲醛封固各孔，使组织孵育30分钟。在切割视网膜前，立即用任氏液配制100微升示踪剂溶液，其中含0.5%神经生物素。

接下来，将神经生物素溶液加入玻璃培养皿中。然后将附着有视网膜的滤纸轻轻在纸巾上轻敲，以去除多余的任氏液。用剃刀刀片蘸取神经生物素溶液，垂直于视网膜及滤纸进行径向切割。

随后，再次将刀片浸入神经生物素溶液中，并对视网膜进行第二次切割。每块视网膜最多重复此操作四次。在此步骤中，将视网膜转移至新鲜的任氏液中，可含或不含待测药物，孵育15分钟，以允许染料加载和扩散。

用新鲜的林格液或含/不含待测药物的培养基洗涤三次，每次五分钟。然后在室温下用4%多聚甲醛溶于0.1摩尔磷酸盐缓冲液中固定视网膜，持续一小时。随后将视网膜置于4摄氏度的0.1摩尔PBS中，在冰箱中过夜洗涤，于次日进行后续操作。

将视网膜与含有0.1摩尔PBS和0.3%Triton X-100的2%链霉亲和素Alexa 488反应，终浓度为每毫升10微克，在4摄氏度下孵育过夜。第二天，在室温下用0.1摩尔PBS洗涤视网膜三次，每次10分钟。

在 PBS 中将视网膜从滤纸上分离。然后使用细刷将视网膜感光细胞面朝上封片于载玻片上，使用 Vector Shield 封片介质。将载玻片置于激光扫描共聚焦显微镜下，对每种实验条件均采用相同的放大倍数、分辨率和设置拍摄图像，以便比较不同实验条件对缝隙功能示踪剂偶联程度的影响。

这是在持续黑暗条件下白天时段光感受器细胞示踪剂偶联的范围，与在存在选择性多巴胺 D2 受体拮抗剂情况下持续黑暗条件下白天时段的对比。请注意，两幅图像中的切边均位于左侧。尽管单张图像可能包含所有标记的细胞，但仍建议对感兴趣区域采集Z轴层扫图像，并将其投影为如图所示的单张图像。

随着在这样的Zack中依次移动，此处显示了光感受器细胞示踪剂偶联的范围。请注意，本图像中的刀片切割位于右侧。为了在LSM图像浏览器中量化示踪剂偶联的范围，请先打开图像，然后点击导出，并将图片保存为包含比例尺的16位无压缩TIF文件，该比例尺应使用NIH ImageJ软件添加至该TIF图像中。

使用孔板安装的视网膜低倍镜图像，测量Alexa 488标记的神经生物素的荧光强度。使用ImageJ软件打开TIFF文件，然后绘制一条与比例尺相对应的直线。接着，进入分析菜单，设置尺度，输入已知距离和长度单位。

然后点击确定。此时荧光测量结果可以以校准单位（如毫米）显示。接下来，使用矩形选择工具选取目标区域。

荧光峰应位于所选区域的左边界。确保右边界附近无荧光信号。点击分析并绘制在持续黑暗条件下获得的白天对照数据的轮廓图。

从左到右显示一条呈指数衰减的曲线。然后在弹出窗口中点击复制，并将其粘贴到 Excel 中。现在有两列数据，一列表示距切割位置的距离，另一列表示作为距切割位置距离函数的荧光强度。

作为对照，将上述步骤在白天恒定黑暗条件下获得的数据重复进行。在存在spit bro的情况下，将每个原始荧光值除以最大荧光值，以获得相对荧光强度。复制与切割距离和相对荧光强度对应的两列数据，然后将其粘贴到Origin软件中。

上述步骤同时适用于白天对照组和白天唾液组。此时的实验数据通过指数衰减函数进行拟合。使用 T 检验或方差分析（Inova）比较不同实验条件下空间常数的数值。

指数函数及对白天对照、白天添加哌罗尼、夜间对照数据的统计分析结果用于对比展示。此处展示了通过切割负载技术揭示的在暗适应条件下，白天（A）、夜间（B）以及在选择性多巴胺D2受体拮抗剂存在下的白天，金鱼视网膜感光细胞示踪剂耦合程度的示例。所有共聚焦图像均采用相同的设置进行采集，以确保可比性。

在此图中，三种实验条件下的荧光强度随距切割处距离的变化情况被绘制出来，并通过指数函数进行拟合。切割加载技术可用于量化间隙连接示踪剂耦合的程度，方法是计算如本图所示三种实验条件下的空间常数。切割加载技术还可用于研究视网膜中其他细胞类型之间以及其它物种中的电突触连接。

例如，这两个图示说明了在暗适应条件下，兔的A型和B型水平细胞在切口加样后，神经生物素在细胞间的示踪耦合表现出同源性。我们已采用切口加样技术来研究在白天和夜间示踪剂通过视杆细胞与视锥细胞之间缝隙连接扩散的程度。此外，该技术还可用于确定其他视网膜神经元之间的示踪耦合是否受视网膜生物钟和（或）特定光照-暗周期条件的调控。

它还可用于研究其他脑区神经元之间的示踪剂偶联。