测量神经肌肉接头功能

本实验的总体目标是通过离体实验方法研究神经肌肉接头的功能。该目标通过两种方式刺激肌肉神经制备来实现：直接刺激肌膜以及通过神经刺激。由于肌膜刺激绕过了神经传导信号，因此两种收缩反应之间的任何差异均可被视为神经肌肉接头功能的间接测量指标。

本文介绍了比目鱼肌坐骨神经标本的实验方法。将肌肉连同其神经一起解剖，并置于灌流的组织浴槽中。肌肉一端固定于力和长度控制器上，一对铂电极平行放置于肌肉两侧。

然后将玻璃吸电极移至神经切断端附近。随后应用一套全面的测试方案，以充分评估神经肌肉接头和肌肉功能。肌肉与神经之间的功能性连接对于两部分及两个存活的片段均成立。

在每个组织水平的第一区域内，两种组织相互沟通，形成这些神经肌肉接头，其通常呈现类似终板的形态结构。然而，在多种病理条件下，肌肉与神经之间的功能相互作用会严重受损，导致神经肌肉接头失去复杂的形态学组织。本实验方案的总体目标是通过使用离体实验方法来研究神经肌肉接头的功能特性。

通过两种方式刺激肌肉神经标本来实现这一过程：一种是直接刺激肌肉膜，另一种是刺激神经并分析肌肉特性。打开循环水浴并调节温度至30摄氏度。

用克雷布斯-林格溶液填充浴槽。使0.4 bar的气体混合物通过氧管并通入浴槽中。打开驱动器换能器和两个脉冲刺激器。

将膜刺激的电流值设置为3亿对，神经刺激的电流值设置为500万对。通过颈椎脱臼法处死小鼠后，去除腿部的皮肤。随后切断跟腱，在牢固钳夹跟腱的同时，向上牵拉腓肠肌和比目鱼肌。

暴露腓肠肌近端肌腱后，将其上方整个小腿部分切断，并迅速将样本置于体视显微镜下的预备组织浴槽中。使用一对镊子紧紧夹住腓肠肌的近端肌腱，轻轻牵拉以暴露坐骨神经支配区域。一旦神经支配区域暴露，清除周围组织，显露出约五毫米长的神经。

然后使用精细的剪刀小心地切断神经。通过切断跟腱以分离比目鱼肌与腓肠肌，完成肌肉和神经的切除。现在，肌肉-神经标本已准备好安装至测试装置上。

在尼龙线末端打一个活结，并将其扎紧在跟腱上。将近端肌腱固定在固定夹中，并将尼龙线绑在力传感器的杠杆臂上。让肌肉在溶液中平衡一段时间。

为了确定初始最优长度，在轻轻改变蠕变负载值的同时，用一系列单脉冲刺激肌肉。当抽搐力达到最大值时，即获得最优长度。将吸电极放置在肌肉附近，并将神经拉入。

然后，在轻微调节脉冲电流值的同时，用一系列单脉冲刺激肌肉。通过神经刺激肌肉所产生的抽搐力应等于在膜上直接刺激时测得的数值。确定最佳电流值后，将神经推出电极，并施加数个电流脉冲。

如果先前选择的电流过大，通过吸电极传递的电流脉冲会经由浴液传导电流，从而引发肌肉收缩。我们利用自行开发的软件设计了一种自动测试方案，用于研究比目鱼肌神经肌肉接头的功能。该方案持续约65分钟，由四个不同部分组成。

在第一部分中，肌肉接受四个单脉冲刺激，其中两个直接施加于肌肉，另两个通过神经传递。随后从肌肉收缩反应中测量达到峰值的时间、半松弛时间、力导数的最大值以及单收缩力。

在第二部分中，使用一系列频率从 20 赫兹到 80 赫兹的脉冲串刺激肌肉，该频率范围即为强直收缩频率。通过计算神经刺激和直接刺激条件下的力量-频率曲线来分析肌肉收缩力。在实验方案的第三和第四部分，肌肉将经历两种疲劳范式，以测量神经传导衰竭和强直期内疲劳。

在这些疲劳实验范式中，肌肉会持续受到刺激，每次先在肌膜上施加一个脉冲序列，随后通过神经施加14个脉冲序列。整个序列重复20次。第一个范式的刺激频率为35赫兹。

在80赫兹的强直频率下进行第二次刺激。神经传导衰竭被认为在疲劳的发生过程中起着重要作用，因为它与动作电位传导的外部阻滞、递质释放减少以及接头后膜兴奋性降低和终板疲劳能力下降相关。神经肌肉接头疲劳能力的另一个方面明显表现为单次强直收缩过程中的收缩期内疲劳，这是对肌肉在单次强直收缩期间维持力量能力的评估，反映了高频疲劳。

在实验方案结束时，使用模拟卡尺和精密天平测量肌肉的净长度和重量，以计算肌肉的横截面积。针对肌萎缩侧索硬化症的 SOD1 转基因小鼠模型的研究已凸显了该方法的潜力。事实上，转基因小鼠的比目鱼肌在直接刺激时，其收缩反应（包括力导数和强直收缩力）均有所降低，而在通过神经刺激时，这种降低更为显著。

以强直收缩力为例，这些实验表明，肌肉收缩性占损伤的25%，另有45%与神经传导缺陷相关。另一个有趣的发现是，在直接或间接刺激时，对照组肌肉未表现出任何差异。该结果证明，实验方法未引入任何技术性假象，因为在对照组动物中，神经肌肉接头应完全正常发挥功能。

关于强直性收缩期间的疲劳，结果显示转基因比目鱼肌的数值显著低于对照组。有趣的是，转基因比目鱼肌在重复刺激下会受到显著损伤，这意味着神经肌肉接头功能的评估最多只能在八分钟的刺激时间内进行。八分钟后，当受到刺激时，转基因肌肉的收缩力几乎降至零。

观看视频后，您应该已经了解如何测量小鼠神经肌肉接头功能及比目鱼肌的功能。由于该技术基于对神经肌肉接头功能的间接测量，因此无法判断所观察到的功能缺陷是否与形态学或生物化学改变相关。另一方面，该方法对于评估这些损伤是否影响神经信号传递的正常功能具有重要意义。

最后，该方案可轻松应用于测量膈肌神经肌肉接头的功能，而膈肌是另一种常受病理疾病影响的肌肉。