一种基于PCR的基因分型方法以区分白茅（Imperata cylindrica）的野生型与观赏型品种

本实验的主要目的是提供一种经济高效且快速的分子基因分型方案，能够区分仅靠形态学特征无法鉴别的圆柱状雷塔草（Retta cylindrica）不同品种，该植物通常被称为冈草。首先需识别并分离目标冈草品种的组织，随后从采集的组织中提取细胞核DNA和质体DNA。

接下来，使用针对PLAs基因LF区域序列差异的品种特异性引物，对提取的DNA进行聚合酶链式反应（PCR），同时设置适当的阳性和阴性对照。最后一步是对四个PCR反应产物进行凝胶电泳，以观察扩增后的PCR产物。最终，通过分析凝胶上出现的品种特异性PCR产物条带，确定所采集的豚草品种。入侵性植物每年给美国造成约34亿美元的经济损失，对农业资源和自然资源均带来严重危害。

野生型象草（imparato Electrica），又称高羊茅草（Cogan grass），是全球十大最严重入侵性杂草之一。高羊茅草可迅速蔓延并形成单一群落，取代本地植被，进而影响依赖这些本地植物生存的动物。目前，高羊茅草在全球已侵染约4.9亿公顷土地，在美国的侵染面积约为50万公顷。一种名为艳山姜（ti of tus centrica）的观赏性变种在市场上广泛销售，其商品名包括 tus Centrica、Arbra、红柄蕉（red Baren）和日本血草（Japanese blood crass），我们将其简称为JBG。该品种被认为不育且无入侵性，因其红色叶片而具有较高的观赏价值。

在特定条件下，日本血草可产生具有活力的种子，并回复为全绿色的表型，与野生型的芒草无法区分。如您所见，二者均具有绿色叶片，且植株更大，叶片更宽，与传统的观赏品种明显不同。此外，回复型植株和野生型植株的根状茎也比观赏品种更大，从而增强了其无性繁殖潜力。

仅通过形态学特征进行鉴定存在困难。分子方法能够准确区分入侵植物及其植物材料，而这些材料无法通过常规的视觉手段进行识别。

分子方法对于防止外来植物的传播和引入至关重要。应用本分子实验方案可准确区分日本血草的返祖植株与胡麻草。该方案有助于避免与胡麻草共同发生及其可能产生的可育杂交种的形成。

与现有的扩增片段长度多态性（AFLP）分析或DNA测序等技术相比，该技术的主要优势在于提供了一种非常经济高效且快速的分子基因分型方法，能够轻松区分野生型高秆红草与日本血草的不同品种。本技术将由本实验室的本科生约瑟夫·赫里（Joseph Hery）进行演示。首先，在高秆红草或日本血草生长的地点选取样本，并需将二者相互区分开来。

日本血草因其鲜红色的叶片而易于与野生型冈草区分开来。然而，日本血草返祖植株与小冠草几乎无法区分，因为它们都具有比观赏性日本血草更长的绿色叶片、更大的叶面积和更粗壮的根状茎。该方法可用于新鲜、冷冻以及近期干燥的叶片组织。

若需将组织保存以备后续进行DNA提取，最佳方法是立即将组织冷冻并储存在-80摄氏度条件下。若必须进行干燥保存，应将组织放入纸袋中，并将纸袋置于干燥的硅胶或其他活性干燥剂中，在室温下保存。若使用新鲜组织，须确保在采集后三小时内完成DNA提取，以防止降解。

本实验步骤采用Kyogen公司提供的DNEZ植物迷你试剂盒，按照生产商说明书进行操作，仅作一处微小修改。本方案已调整为使用超过100毫克的新鲜或冷冻组织，或超过20毫克的干燥组织。首先，取超过100毫克的新鲜或冷冻叶片组织，或超过20毫克的干燥叶片组织，加入液氮，于预冷的研钵和研杵中研磨三次，直至形成细粉。

将新鲜或冷冻组织的冻干粉末称重，分为每份100毫克的等分试样。若使用干燥叶片组织，则将粉末称重分为每份20毫克的等分试样。此后，按照制造商说明书进行DNA提取，使用分光光度计（如NanoDrop分光光度计）检测DNA的质量和数量，良好的DNA得率应在每微升50至150纳克之间，且A260/A280和A230/A280比值接近2.0，如下所示。

使用标准的1% AROS凝胶进行电泳。若DNA浓度较高，通过观察是否存在大于10 KB的相对较大条带，并确认无或仅有少量RNA污染造成的拖尾现象，来验证结果。若DNA浓度过高，将样品稀释至每微升70纳克，用于后续步骤。本方案中使用的PCR引物（由红色和绿色箭头指示）基于铺地狼尾草（Cogan grass）与日本血草（Japanese blood grass）基因型在转录间隔区（LF spacer region）的序列差异设计。

这些差异以单核苷酸多态性以及由垂直黑色箭头指示的插入和缺失形式存在，可用于开发特定品种的引物。通过将引物定位在独特序列位点处，引物序列包含在每个分离DNA样本的书面实验方案中。根据书面方案，使用每对引物在冰上用0.2毫升薄壁PCR管设置两个50微升PCR反应。如果DNA浓度较低，可向每个反应中加入更多DNA，同时调整无核酸酶双蒸水的用量，使总反应体积保持为50微升。

每次反应中使用的DNA体积不要超过5 µL，或总体积的10%，因为DNA样本中的杂质可能会抑制PCR反应。为确保所有PCR试剂均正常工作，必须设置阳性对照。使用阳性对照引物进行扩增，同时使用与阳性对照相同的引物组合设置阴性对照，但以双蒸水代替提取的DNA。此时，每个待测样本共需进行四次PCR反应。接下来，在配备加热盖的热循环仪中进行PCR扩增，采用书面实验方案中指定的PCR循环参数。根据DNA质量、引物特性、聚合酶类型或所用热循环仪型号的不同，可能需要对退火温度、延伸时间及循环次数进行优化。

PCR 反应完成后，使用标准电泳方法在 1% 琼脂糖凝胶上分离 PCR 产物。以约 120 伏电压电泳，直至溴酚蓝指示线迁移至凝胶总长度的四分之三处。在紫外光下观察凝胶，并检查所获得的条带，以确认是否扩增出合适的 DNA 片段。

该代表性凝胶展示了利用Kogan草、日本血草及日本血草回复体DNA样本，结合Kogan草和JBG特异性引物进行PCR扩增后，对产物进行电泳的结果，同时包括萝卜LF阳性对照和无模板阴性对照。萝卜LF阳性对照引物组可等效扩增Cogan草、日本血草、日本血草回复体及其他禾本科植物，产生一条890个碱基对的条带。若所有PCR试剂均无DNA污染，则阴性对照反应不会产生PCR产物。

如果DNA样本来源于野生型Kogan草，则使用Kogan草特异性引物组进行PCR反应将产生一条约595个碱基对的条带，而使用JBG特异性引物则不会产生条带。同样，如果DNA样本来源于JBG或回复突变的J-B-G-A-P-C-R反应，使用JBG特异性引物组将产生一条约594个碱基对的条带，而使用Kogan草特异性引物则不会产生条带。

由于JBG和恢复型JBG具有相同的核酸序列，因此它们的电泳条带模式也将完全相同。然而，JBG与JBG恢复型之间的形态学差异较为明显，因此尽管PCR结果一致，但在植株水平上仍易于区分这两种JBG品系。对PCR产物进行DNA测序，可鉴定不同伴生草生态型之间DNA序列的可能变异。

该技术的开发首次提供了一种简化的分子方法，能够准确区分野生型K草与其观赏品种日本血草的回复突变形式。我们鼓励本方案的使用者与我们联系，报告使用本方案所获得的结果。此类共享信息将有助于了解日本血草的分布情况。

这还将帮助美国农业部的监管人员就可能需要采取的措施做出知情决策，以防止高度入侵性的高羊茅草品种的扩散及其潜在的杂交。