蛋白质膜覆盖实验：检测可溶性与不溶性蛋白质相互作用的实验方案 体外

检测蛋白质。蛋白质相互作用对于解析蛋白质功能至关重要。本视频介绍了一种体外蛋白质-蛋白质结合实验方法，用于检测膜结合蛋白或固定化蛋白与可溶性蛋白之间的相互作用。

首先，克隆、表达并提取融合蛋白。将带有标签的不溶性蛋白固定在硝酸纤维素膜上，并处理使其复性至天然构象。然后用带有标签的可溶性蛋白探查膜，并通过免疫印迹检测蛋白。

如果标记的蛋白质发生相互作用，则会被固定在膜上的蛋白质捕获，并可通过免疫印迹检测到信号。因此，该检测方法为验证不溶性蛋白质与溶液中蛋白质之间的相互作用提供了一种可靠手段。与现有的GST pull-down等方法相比，该技术的主要优势在于能够可靠地在体外评估不溶性蛋白质与可溶性蛋白质之间的结合能力。

该实验步骤的第一步是生成用于检测的基因标记蛋白。首先克隆将要固定在膜上的蛋白，此处将其称为固定化蛋白（pro Im），并将其插入表达载体中，该载体编码一个较大的标签，例如 GST；仅编码标签的空表达载体将用作固定化蛋白的阴性对照，此处称为 pro IM nc。

接下来，将用作可溶性探针的蛋白质克隆到表达载体中，该载体编码不同的标签，例如Strep标签（strep two）。该构建体将被称为prosol（可溶性蛋白质），作为阴性对照；同时将一个阴性对照的可溶性蛋白质克隆至相同的表达载体中，该构建体将被称为Prosol NC（可溶性蛋白质阴性对照）。

接下来，使用蛋白表达系统（如大肠杆菌或杆状病毒）来表达带标签的蛋白，所选用的表达系统应根据翻译后修饰的需求谨慎选择。从选定的生物体中提取表达的蛋白。针对前体胰岛素原和前体胰岛素原mnc恒河猴。

在含有蛋白酶抑制剂混合物的SDS-PAGE上样缓冲液中重悬细胞。然后将细胞煮沸5分钟，再离心以去除沉淀物，从而提取Prosol和prosol NC。采用标准操作步骤。pro IMS可在变性条件下提取，因为蛋白质在固定于硝酸纤维素膜后会重新折叠。

然而，应提取prosol以获得天然构象，因为一旦带标签的蛋白质被提取出来，prosol将被加入到结合缓冲液中。使用标准方法（如BioRad蛋白检测试剂盒）测定重组蛋白的浓度。如果实验将使用粗提物而非纯化蛋白。

通过考马斯亮蓝染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶上目标蛋白对应条带的扫描光密度分析，估算目标蛋白的浓度。以已知浓度的牛血清白蛋白（BSA）作为参考，根据BSA的扫描光密度测得的信号强度绘制标准曲线，并计算粗提物中所含蛋白的量。

该实验步骤的下一步是将前体Iam和前体IAM NC固定在膜上。首先，将前体Iam和前体IAM NC提取物分别以每份1微克的量，重复加样至SDS聚丙烯酰胺凝胶中。电泳结束后，将凝胶从玻璃板中取出，放入100毫升转膜缓冲液中，并在室温下轻轻振荡孵育20分钟。

孵育结束后，进行蛋白质印迹（western blot），将蛋白质转移至硝酸纤维素膜上，转移后使膜上结合的蛋白质复性。将膜置于15毫升缓冲液A中，在温和振荡条件下孵育。为去除残留的SDS，在室温下温和振荡孵育15分钟。

孵育结束后，小心地将膜从缓冲液中取出，然后将其放入25毫升变性缓冲液中，在室温下轻轻振荡孵育2小时。

孵育过程中，硝酸纤维素膜将变得不透明。接下来，用镊子将膜转移至25毫升TBS中，在温和振荡条件下孵育5分钟。此步骤中，膜将恢复至其原始的白色。

接下来，将膜转移至25毫升结合缓冲液中，在4°C下轻轻振荡孵育过夜。随后，使用可溶性蛋白作为探针检测膜上固定的蛋白。

首先，配制杂交缓冲液：在分别装有 10 毫升新鲜结合缓冲液的试管中，将 prosol 和 prosol NC 各稀释至一到十微克。然后将缓冲液转移至杂交袋中。接着，将膜切成两条，每条均包含 pro IM 和 pro IAM nc。

将这些膜放入杂交缓冲液中。将每张膜转移至prosol或prosol NC杂交溶液中，在室温下轻轻振荡孵育1.5小时。从杂交溶液中取出膜，用TBS洗涤三次，每次15分钟。

为了观察蛋白质-蛋白质相互作用，用含2.5%脱脂奶粉的TBST溶液室温封闭膜1小时。孵育结束后，将封闭好的膜置于一抗溶液中。此处使用抗Strep II多克隆兔抗体。

孵育结束后，在室温下轻轻振荡孵育一小时。用 20 毫升 TBST 在室温下轻轻振荡漂洗膜 15 分钟，随后再漂洗两次，每次 5 分钟。接下来将膜置于 HRP 标记的二抗溶液中。此处使用 HRP 标记的抗兔 IgG 抗体。

室温下轻柔振荡孵育1小时。用20毫升TBST室温轻柔振荡洗涤膜15分钟，随后同样条件振荡洗涤两次，每次5分钟。最后一次用TBS洗涤后，使用HRP化学发光底物（Millipore）检测蛋白质-蛋白质相互作用。Im Molan Western Chemiluminescent。

在目的蛋白的免疫印迹后使用 HRP 底物。室温下用 TBST 将膜漂洗 15 分钟，再重复漂洗两次，每次 5 分钟。然后使用针对标签的一抗对膜重新进行探针杂交。

随后加入相应的二抗。通过检测化学发光来显示PRO I和pro Im NNC，以验证蛋白质膜覆盖实验中获得条带的身份。如图所示，利用本视频中所述方法，在烟草表皮细胞中评估了蛋白质A与K以及YFP与MP CYFP之间的相互作用。

当检测双分子荧光互补时，观察到强烈的YFP信号重建。该BFC信号在细胞边缘的Punta处积累，这是质膜的诊断性特征，因为MP是一种高度不溶性蛋白。当在细菌或植物中表达时，采用蛋白膜覆盖实验来验证这一相互作用。

含有1微克GST MP或未融合GST的体外蛋白提取物通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，随后电转至硝酸纤维素膜。当用可溶性Strep二标记的ANK STREP二探针检测这些蛋白印迹时，仅GST MP（而非未融合的GST）显示出结合信号。此外，当用无关的Strep二标记的拟南芥细胞质NADH激酶探针检测同一组蛋白印迹时，未观察到结合信号，进一步证明了ANK MP相互作用的特异性。在尝试该实验流程时，重要的是需牢记按照所提供的方案正确地重新填充固定化蛋白。