一种构建突变型痘苗病毒载体的简单高效方法

本实验的总体目标是利用 CRISPR-Cas9 技术提高突变型痘苗病毒制备的效率。该方法有助于创建新的痘苗病毒载体，用于生物学和医学研究，特别是基因治疗和疫苗接种研究。采用该方法进行病毒验证至关重要，因为识别和挑选阳性噬斑的操作难度较大。

该技术的主要优势在于能显著提高构建突变型痘苗病毒的效率。从收获的CV-1细胞开始，将其浓度调整为每毫升10万个细胞。然后将两毫升细胞悬液接种至6孔板的每个孔中，用于转染。

第二天，用 0.5 纳克 gRNA-N2 质粒和 0.5 纳克 pSTCas9 质粒转染细胞，然后孵育 24 小时。24 小时后，更换培养基。

接下来，准备VVL15病毒。用DMEM将骨架VVL15病毒稀释至每毫升200,000 PFU。然后将100微升稀释后的病毒加入转染的CV-1细胞的每个孔中。

2小时后，用一微克穿梭供体质粒转染细胞以表达HR，并将细胞继续培养24小时。次日，使用细胞刮刀将转染后的CV-1细胞刮下，收集细胞悬液至冻存管中，于-80°C保存，以备后续使用。

开始第一轮修饰型VV纯化时，将15块六孔板每孔接种300,000个未修饰的CV-1细胞。次日，将转染后的CV-1细胞冻存悬液在37摄氏度下解冻三分钟，然后剧烈涡旋振荡30秒以裂解细胞。随后，将一微升裂解液用三毫升DMEM稀释。

将此稀释液0.5 mL加入至每孔未修饰的CV-1细胞中，然后将培养板放回培养箱中培养两天。两天后，使用荧光显微镜鉴定RFP阳性噬斑。

可用10倍物镜观察到它们。一旦识别出噬斑，立即使用记号笔在培养板底部准确标记。现在，为每个待收获的阳性噬斑准备一支含有200微升无血清DMEM的冻存管。

接下来，重要的是吸出含有标记斑块的孔中所有的培养基。然后，将200微升移液器设定为吸取30微升，先用移液器吸取冻存管中10微升培养基，随后刮取斑块，并利用剩余的吸液体积将细胞吸起。将吸取物排入冻存管中，并重复此操作两次，始终针对同一个RFP阳性斑块，以尽可能收集更多的细胞。

将收集物保存在负80摄氏度条件下；或者，如果要立即进行第二轮纯化，则将冻存管在干冰上冷冻10分钟。使用第一轮获得的冻存细胞，以与第一轮相同的方法进行第二轮修饰型VV的纯化。然而，每条RFP阳性细胞系可选择六个以上的RFP阳性噬斑。

重复筛选过程，直至来自一个阳性噬斑的所有噬斑均呈红色荧光蛋白阳性（RFP阳性），表明该噬斑已纯化，此过程可能需要额外三至五轮。提前一天，准备六孔板，每孔接种50万个CV-1细胞。次日，将冻存的纯化噬斑在37摄氏度解冻三分钟。

然后剧烈涡旋震荡斑块30秒以制备裂解液。将全部裂解液（包括细胞碎片）加入CV-1细胞的一个孔中，并将培养板孵育三天。其余五个孔不要使用。

每天在显微镜下观察细胞。当超过一半的细胞出现细胞病变效应时，收获感染的细胞。理想情况下，所有细胞均应出现细胞病变效应。

使用细胞刮刀将细胞收集至含有培养基的15毫升离心管中。随后在300×g离心3分钟以沉淀细胞。弃去上清液，立即采用PCR验证突变型VV的修饰情况，或在-80°C下冻存细胞沉淀以备后续检测。

与传统方案相比，所述方法将重组效率提高了100倍以上。例如，对VV N1LG进行了靶向修饰。如所述，将表达Cas9和N1L特异性gRNA的质粒共同转染至CV-1细胞中，以提高其同源重组效率。

转染后一天，CV-1 细胞中表达了 RFP。随后，用同源重组的全裂解物感染 CV-1 细胞。在 CV-1 细胞中同时观察到 RFP 阳性和阴性噬斑。

按照纯化方案，获得了纯的重组病毒。用来自纯化斑块的突变型痘苗病毒感染细胞裂解物后，所有斑块均呈现红色荧光蛋白（RFP）信号。采用PCR验证了目标基因的缺失。

经修饰的病毒显示出RFP的阳性信号，而N1L无信号，与完整的N1L对照不同。所有样本均显示非靶向基因A52R为阳性。观看本视频后，您应能充分理解如何快速构建新的痘苗病毒载体。

一旦掌握，该技术若操作得当，可在10天内完成。该技术建立后，为生物医学领域研究人员探索新型病毒载体以开发用于癌症和传染病治疗与预防的生物制剂铺平了道路。