原位 杂交技术用于植物中转录本的精确定位

本实验的总体目标是在细胞水平上以高灵敏度和特异性可视化 mRNA 的表达模式。首先将经过福尔马林固定和石蜡包埋的组织切片通过一系列溶液处理，以去除石蜡、通透组织，并封闭组织中带正电荷的内源性基团，这些基团可能产生背景信号。随后，将针对目的基因的 DIG 标记 RNA 探针渗入组织切片中，并将载玻片在适宜条件下杂交过夜。

接下来，将切片用 RNAs A 处理，以去除切片中非特异性结合的探针，然后与抗 DIG 抗体孵育。这可通过比色化学反应实现对杂交探针的可视化。

结果显示，在组织内目的基因表达的细胞中，可通过光学显微镜检测到深蓝色信号。与R-T-P-C-R、微阵列或下一代测序等其他表达分析方法相比，该技术的主要优势在于，本文所示的原位杂交实验方案能够揭示目的基因在其组织环境中的表达模式。这些方法包含多个步骤，通过视频演示学习效果最佳。

我们将展示如何对组织进行切片和包埋，以及在Al杂交实验方案中一些难以自行掌握的关键步骤。对于经戊二醛固定的组织，其包埋方法将根据待分析组织的类型而有所不同。此处最重要的环节是确保样本在后续切片时具有正确的方向性。

一种包埋方法是使用塑料模具和模具环。开始此操作时，将模具置于60摄氏度的加热板上预热，然后将熔化的石蜡倒入模具中。接着，使用预热的镊子将组织样本转移至每个模具内，并将其调整至所需的位置。

小心地将模具从载物台移至实验台，将白色环状物放置在模具上。加入额外的摩尔量（mol）和石蜡。在切片前，让石蜡逐渐冷却并完全固化。

将包埋块升温至室温，然后将其修整为梯形，样品周围保留约一毫米的石蜡。将修整好的包埋块放置于切片机上，使两条平行面中较长的一侧位于底部。小心地将包埋块向前推进至刀刃处，并确保包埋块表面与刀片切面平行。

厚度为8到10微米。将石蜡带置于防粘表面（如铝箔）上，并在解剖显微镜下选择感兴趣的切片区域。接着，用铅笔标记prob bon plus载玻片。

请勿使用记号笔标记，因为在进行 INI 双杂交实验时标记会被擦除。将一毫升洁净的 Milli-Q 水均匀滴加到每张载玻片上。在室温下，小心地将感兴趣的切片漂浮于水面。

确保有光泽的一面朝向水。将载玻片缓慢转移至载玻片加热台上，温度设置为 35 至 37 摄氏度。

与常用的42摄氏度相比，此温度范围可防止切片下方产生气泡。五分钟后，小心地一次性将水倒出，使切带平缓地降落在载玻片上。将载玻片在37摄氏度下干燥至少数小时或过夜，以使组织牢固附着，从而制备组织切片。

进行原位杂交时，首先对样本进行脱蜡并重新水化以完成脱蜡步骤。将载玻片先后浸入两份组织清除剂溶液中，每次10分钟。为使组织切片重新水化，需将载玻片依次通过浓度递减的乙醇溶液，每步30秒。

在蛋白酶处理过程中（本视频未展示），准备一个盛有 0.1 摩尔三乙醇胺溶液的玻璃皿，并将其置于通风橱内的搅拌器上。在将金属载片架放入溶液前，立即向三乙醇胺缓冲液中加入 1.25 毫升乙酸酐，并搅拌均匀。此外，安装好用于固定载片架的夹紧装置和支架。

降低Starr夹的速度，将载玻片架夹到支架上，并将架子放入溶液中，保持其高于搅拌子。在用PBS冲洗并再次通过乙醇系列脱水后，继续缓慢搅拌10分钟。组织切片现已准备好进行杂交。

将载玻片置于洁净的表面上，室温下完全干燥5到10分钟。通过将变性的探针加入80微升杂交缓冲液中，制备探针杂交缓冲液混合物。每张载玻片均需用移液器反复吹打混匀，注意避免产生气泡。

用移液器吸取探针杂交缓冲液，将其混合至载玻片的右侧边缘。逐渐将盖玻片放下，覆盖在载玻片上，确保杂交溶液覆盖所有组织区域，且无气泡产生。

用手指轻轻敲击盖玻片上气泡形成的位置，以驱除所有组织切片中的气泡。切勿撕下盖玻片，以免损伤切片。将载玻片置于湿盒中，湿盒内放置经超纯水润湿的Watman滤纸，并用Parafilm膜大面积覆盖。

将盒子密封后，在所需的杂交温度下孵育载玻片，通常为 50 至 55 摄氏度，孵育 16 至 20 小时。杂交程序完成后，小心地从载玻片上移除盖玻片。当载玻片直立时，盖玻片可能会自行脱落；若未脱落，切勿强行撕下盖玻片，以免损伤组织切片。

去除盖玻片后，将载玻片浸入温热的0.2倍SSC溶液中1至2分钟，以洗去盖玻片，随后将载玻片放入染色架中，并在55摄氏度下用0.2倍SSC溶液多次洗涤。RNA处理后，将载玻片从染色架转移至平底塑料盒底部，并加入最小体积的封闭液覆盖载玻片。在室温下，于缓慢摇动的平台上封闭45分钟。

接下来，将少量抗体溶液直接加到每张载玻片上。室温下避光孵育 2 至 3 小时。孵育完成后，将载玻片转移至一个洁净的平底盒中，并在摇床上用少量洗涤缓冲液于室温下洗涤 4 次。

用TBS缓冲液冲洗载玻片一次，再用TN缓冲液冲洗两次，随后即可施加新鲜配制的染色液。首先，将染色液倒入一个小的塑料称量皿中。然后将两张载玻片夹在一起，使组织切片面相互对向。

将三明治结构浸入溶液中，利用毛细作用使溶液上升。将载玻片在无尘纸上沥干。向载玻片中加入染色液。

同样，当溶液流入时可能需要轻敲载玻片以避免产生气泡，然后将载玻片放入塑料盒中，于室温避光保存。此处展示了使用不同探针和拟南芥组织获得的代表性结果。紫色信号可在细胞水平上直观显示目的基因的表达模式。

图A显示了营养生长阶段茎尖分生组织中Meli one转录本的定位情况。注意分生组织的未定型区域存在紫色蓝信号，而周围叶片中无此信号。图B至图D为拟南芥鱼雷期胚胎的切片，其中图B显示covata three在少数胚胎干细胞中表达。

C 显示表皮层中 T ML 一个基因的表达，D 显示使用随机阴性对照 RNA 探针的切片中无信号。接下来的图像展示了在玉米组织上使用不同探针获得的结果。图 E 显示 STM Humalog knotted 一个基因在发育中的玉米胚胎中的定位。

注意，在胚胎中胚和根部通过营养鞘顶端的纵切面中，信号特别强，表明在图 F 中，ARF3A 在轴向叶基部表面表达，而 ATML1 同源基因 OCL4 在表皮中特异性表达。如图 G 所示。如预期，在图 H 的阴性对照探针中未观察到杂交信号。此处展示了体外转录探针过程中不同检测点的预期结果。体外转录后，经 DNA 酶处理并随后纯化体外转录反应产物后，将原位杂交探针在标准 ARAZ 凝胶上进行检测。对于长度超过 250 个碱基对的探针（如探针 1），在碳酸盐水解后并准备使用时，碳酸盐水解将产生一系列较小的探针片段。

该图显示了通过点杂交分析对探针进行颜色和定量评估的结果，分析中使用的稀释梯度为10⁻¹至10⁻⁵，起始浓度为100 纳克/微升的对照探针，以及三个新标记的DIG探针。这些探针点样于转移膜上，经抗DIG抗体孵育并进行检测。分析结果表明，探针二的浓度约为100 纳克/微升，探针三为10 纳克/微升，探针四为1 纳克/微升，提示探针四可能难以产生良好的原位杂交信号。最后，这些来自Mace品种营养鞘顶端的纵切面图像提供了非特异性背景信号与有效探针信号之间的对比。

A 显示非特异性背景信号，而 B 显示 OC five 探针在外层细胞中的特异性原位双杂交信号。观看本视频后，您应能较好地掌握原位杂交实验中多个关键步骤的操作，从而能够确定您感兴趣的基因的精确时空表达模式。