单个细胞中转录本标记方法 大肠杆菌 用于单分子荧光的细胞 原位 杂交实验

本实验方案的总体目标是对大肠杆菌（E. coli）中的单个转录本进行标记，使用荧光标记的DNA探针，以便在单分子荧光原位杂交（FiSH）实验中实现可视化。该方法有助于回答系统生物学领域中的一些关键问题，例如表征特定研究领域中转录本在细胞间的分布差异，以及转录本在细胞壁上的定位情况。

该技术的主要优势在于能够提供有关转录过程统计学的大量信息。开始实验前，将大肠杆菌MG1655在LB培养基中于37摄氏度、260 RPM的摇床中过夜培养。次日，将过夜培养物按1:100的比例接种至新鲜培养基中，并使用分光光度计测量其光密度，直至达到0.2至0.4的数值。

接下来，将细胞在4,500 ×g、4°C条件下离心5分钟，使细胞沉淀。弃去所有离心管中的上清液。每管加入1毫升1×PBS，重悬沉淀，以尽量减少细胞间的聚集。

然后加入 4 mL 固定缓冲液，轻轻涡旋混匀试管。将样品置于摇床中孵育。重悬沉淀，以尽量减少细胞间的聚集，避免影响细胞成像。

孵育后，离心收集细胞，弃去上清液，加入1毫升1×PBS。将悬液转移至1.8毫升锥底微量离心管中。通过离心收集细胞。

开始细菌透化：小心移除上清液，使用小体积移液器彻底去除沉淀外的所有液体。随后，将沉淀重悬于 300 µL 经 DEPC 处理的水中。

加入 350 µL 高纯度无水乙醇，通过轻轻倒置离心管来温和混匀溶液。再加入 350 µL 乙醇，再次混匀。然后在室温下以 20 RPM 的转速使用离心管旋转仪旋转样品 1 小时。

将透化后的细胞离心收集沉淀。离心后，弃去上清液。向样品中加入1 mL 20%洗涤缓冲液。

静置数分钟。随后，在4℃条件下以750 G离心7分钟，使细胞沉淀。小心地弃去上清液，并使用小容量移液器彻底去除沉淀周围的所有液体。

然后将寡核苷酸探针组原液加入杂交缓冲液分装液中，使寡核苷酸终浓度为 250 纳摩尔，并剧烈涡旋混匀。将样品悬浮于含有寡核苷酸探针的 50 微升杂交缓冲液中，注意避免产生气泡。将样品置于 30 摄氏度的加热块上，避光孵育过夜。

为准备洗涤步骤，为每个待成像样本取一个新的微量离心管。向每根管中加入一毫升洗涤缓冲液。将杂交样本中的10至15微升液体加入含有洗涤缓冲液的新管中。

通过离心收集细胞沉淀。然后弃去上清液。再用洗涤液清洗样品两次。

将沉淀重悬于25微升洗涤缓冲液中。通过将150毫克琼脂糖加入10毫升2X SSC缓冲液中制备琼脂糖凝胶。每次微波加热10至15秒，直至琼脂糖完全溶解。

然后将试管放置一旁冷却几分钟。接着，在载玻片上放置一个分隔用的硅胶框架，使载玻片的中心区域保持暴露。将一个宽10毫米、厚1至2毫米的刚性环置于载玻片的中央。

在中心位置滴加少量凝胶用于封固，静置几分钟使凝胶硬化。然后继续添加凝胶，直至形成较高的圆顶状。再静置约10分钟使凝胶完全硬化，随后取下环状模具。

取10微升洗涤后的细菌细胞滴加到凝胶上，并用0号盖玻片封片。将样品避光保存，防止光漂白。大肠杆菌细胞的smFiSH测量结果显示了galK基因在不同胞外D-岩藻糖浓度下的诱导水平。

背景信号由 galK 缺失菌株（即 delta galK JW0740）作为阴性对照显示。在大多数细胞中可见多个斑点，这对应于当向细菌培养物中加入 2 毫摩尔 D-岩藻糖时的单个或少数 galK 转录本。

而在无胞外D-岩藻糖存在时，仅可见少量斑点。该实验方案的另一个应用实例是sodB基因，在野生型或JW1648 sodB基因缺失菌株中进行smFiSH检测所获得的荧光与相差显微图像。采用本方案制备的样品也可用于STORM成像，从而实现对细胞内转录本的精确定位。

该技术问世后，为系统生物学领域的研究人员探索单个细胞中转录事件的统计特性开辟了道路。