利用光学反射和自发荧光信号成像小鼠嗅球中的气味诱发活动

本实验的总体目标是在麻醉小鼠并暴露颅骨后，利用内在光学信号和黄素蛋白自体荧光信号（即FAS成像）来绘制小鼠嗅球表面由气味诱发的神经活动图谱。嗅球上方的颅骨被磨薄，使用手术刀尖端切出骨瓣并移除，随后用牙科水泥制作一个围绕嗅球暴露表面的成像腔室。

加入染料后，将盖玻片置于该制备样品之上。使用内在光学信号和FAS成像技术，可在同一只小鼠中依次获取嗅觉图谱。利用光学反射和自发荧光信号成像小鼠嗅球中其他诱发活动，有助于回答关于嗅球内气味编码空间分布的关键问题。与现有的其他方法（如2-脱氧葡萄糖成像或功能性磁共振成像fMRI）相比，该技术的主要优势在于能够以单个嗅小球的分辨率记录气味诱发的活动。

通常，初学者在刚开始操作时会遇到困难，因为手术技能和仪器操作技能都需要较长时间才能掌握。对该方法进行可视化演示至关重要，可帮助关注手术和成像过程中的关键步骤。通过夹捏小鼠后肢以确认麻醉效果，并使用电推剪去除头皮部位的毛发。

用浸有蒸馏水的无菌纱布擦拭皮肤上残留的毛发。将小鼠置于立体定位仪框架中，使鼻部与头部后侧处于同一平面。为使嗅球水平定位，需牢固固定耳杆和鼻杆，以防止移动。

成像过程中，为防止眼睛干燥，需涂抹眼用软膏，然后使用无菌剪刀以聚维酮碘消毒头皮区域。在耳后头部背面做切口，然后沿两侧向耳基部、沿眼睑向额部方向做前后向切开。最后通过剪开吻部皮肤，完成头皮的剥离。

以鼻杆作为引导，将动物置于体视显微镜下，用浸有生理盐水的棉签轻轻剥离颅骨顶部的骨膜。使用一对镊子去除残留组织，并用手术刀刮擦颅骨表面，确保暴露区域清洁，以便在整个实验过程中保持嗅球区域湿润。

将一块吸收性明胶海绵用蒸馏水浸湿后，置于两眼之间嗅球上方的骨头上。移除明胶海绵，使用10号手术刀片轻轻刮除骨头。保持刀片与骨头之间约45度的恒定角度，将刀片从眼睑方向向嗅球区域的矢状侧移动。

在磨薄过程中，注意不要对颅骨施加垂直压力，或刮擦静脉窦上方的骨质。每五分钟暂停一次，将湿润的明胶海绵置于骨面上以冷却样本。用海绵擦拭颅骨，清除骨屑和粉尘，并定期清洁手术刀刀尖，保持其清洁与锋利。

继续操作直至观察到疏松骨层或小梁。当嗅球的细小血管结构可见时，停止刮除骨质，并使用11号手术刀的刀尖在嗅球周围划出一个矩形区域并将其围合。保持窗口位于静脉窦边界内，继续刮除矩形区域内的骨质。

操作时需格外注意手术刀尖的深度，避免触碰到硬脑膜表面。为判断残留骨层的厚度，可用镊子尖轻轻推动骨层。若骨层在压力下发生弯曲，则进入下一步操作。

加入一滴生理盐水，用刀尖水平方向轻轻抬起骨瓣。使用镊子小心移除骨瓣，避免撕裂残留的骨骼。一旦嗅球表面暴露，检查是否无出血或可见血管。吻合。

用浸有生理盐水的明胶海绵擦拭该区域。为保持嗅球湿润，使用29号注射器将聚丙烯酸酯牙科水泥涂抹于颅窗周围的骨面上，形成一个围堰。在硬脑膜上滴加一滴低熔点石蜡，然后将无菌盖玻片置于颅窗上，用于成像。

将立体定位架置于体视显微镜下，使颅窗位于视野中心并对焦，以观察到毛细血管。切换至580纳米绿光，采集解剖对照图像，以在成像过程中检查制备状态。随后开始采集刺激试验数据，可选择在630纳米光照下进行内在光学信号成像，或在480纳米光照下进行黄素蛋白自发荧光信号成像。一次标准成像过程包括5到10秒的基线期，期间仅输送空气，随后进行3到10秒的气味刺激，具体时长取决于所选的气味浓度。

最后，记录 70 至 82 秒的空气输送以获取基线恢复数据。在此过程中，通过颅窗对嗅球的血管系统进行成像，随后展示使用 h sinal 作为气味剂的刺激实验结果，该结果通过 iOS 和 FAS 成像技术同时捕获。在 iOS 成像中，气味诱发的活动表现为吸收区域的暗区，AL 激活的区域由白色箭头指示，单次及多次平均试验中均可观察到活跃区域。

在同一只小鼠中切换至FAS成像，由黑箭头指示的自体荧光发射所显示的OD诱发活动现表现为白色区域，并可在单次及多次平均试验中均被观察到。注意，采用iOS成像观察到的黑色吸收区域与采用FAS成像观察到的自体荧光发射白色区域存在重叠。这种空间上的匹配证实了这两种技术均可用于可视化相同的嗅觉小球。利用光学反射和自体荧光信号进行全脑成像以记录诱发活动，手术时间约为一小时，图像采集则需数小时。

使用这些光学成像方法的主要缺点在于，它们无法用于在自由活动的小鼠中可视化嗅觉图谱。并且由于光子在生物组织中的穿透深度有限，因而在二十世纪九十年代末期嗅觉系统内在信号记录技术发展之后，也无法获取腹侧嗅小球的信号。或许，该领域从事光学成像的研究人员可以探索一种针对气味特殊包被特性的研究途径。

在嗅球中，黄素蛋白自体荧光成像是一种有前景的技术，可通过内源性光学信号为研究嗅小球的空间包被提供新的见解。