一种简化的小鼠缺血性伤口模型制备技术

以下实验的总体目标是实现不仅在正常兔子中，而且在具有抵抗力下降的兔子（如老年或糖尿病兔子）中创建缺血性伤口。目前用于制造缺血性伤口的所有技术都具有高度侵入性，迄今为止，尚无任何一种技术可用于糖尿病动物。本方法采用微创手术，首先在三个血管束上方各做一个小的皮肤切口。

下一步是分离并保护中央静脉和耳后血管束，以减少耳部的血液供应，但不完全阻断。最后，通过皮肤切口切断或结扎其余的血管、神经和皮下组织。通过动脉搏动消失、耳部外观、温度差异以及皮下血氧饱和度来确认耳部缺血。

这种微创手术看似难以操作，但实际上非常容易。该技术的主要优势在于对皮肤的损伤极小。自2007年我们首次发表该技术以来，已收到大量相关问题。

此后我们进一步简化了该操作流程。为使操作更加简便且无需使用显微镜，首先称量所选兔子的体重，随后使用氯胺酮和赛拉嗪混合物对兔子进行麻醉。监测兔子的生命体征，可在耳背侧辨识出三条供应耳部的血管束。

这些包括中央束，它是最大的一束，其侧支与其他血管相连；尾侧束，其中动脉通常非常小或缺如；以及颅侧束。在腹侧，远端皮肤的血液供应不来自近端血管。

相反，耳背侧的血管束会发出大量穿透软骨的分支，为远端腹侧皮肤提供血液供应。在一些兔子中，腹侧还存在一条非常细小的皮下血管，但其供血范围不超过腹侧皮肤的三分之一。在行开放环形皮肤切口时，腹侧切口基本不出血。

在继续操作前，通过脚趾夹捏测试疼痛刺激反应，并利用角膜反射确认兔子无反应；通过涂抹人工泪膏保护动物的眼睛；手术过程中使用加热垫保持兔子体温。然后使用聚维酮碘和酒精擦拭双耳及其周围皮肤，并对兔子进行铺巾，仅暴露双耳。

一只耳朵将被造成缺血，而另一只耳朵作为对照。手术所用器械包括带15号刀片的手术刀、两对镊子（一对用于皮肤，另一对用于其他软组织）、三把蚊式钳、一至两对弯头显微剪刀、一对用于剪断缝线和坚韧组织的小剪刀、持针器以及若干不锈钢打孔器。

通过识别动脉和静脉确定三条血管蒂，开始手术。使用15号刀片，在中央血管蒂上小心地做一个垂直皮肤切口。

分离中央静脉并保护其周围组织。此步骤围绕中央静脉进行游离，以便牵拉。

游离出中枢神经。它通常位于静脉的内侧。用剪刀将神经切断。

游离中央动脉。该动脉通常位于头侧，位置较静脉更深，结扎并切断动脉。清理耳软骨上方中央静脉周围的组织。

在精索蒂上方做第二个皮肤切口，以保护精索内的组织束。游离血管并将其环绕，以加以保护。

当静脉较粗大时（如此处的兔子），此操作尤为有用。在此切口与第一个切口之间制作一个隧道。切开覆盖在软骨上的皮下组织。

在颅侧束上方做第三个皮肤切口。整个束被结扎并分离。第三束上方的皮肤被切开。

这条静脉非常靠近皮肤，因此不要切得太深。然后将整个血管束游离出来，结扎并分离。使用手术刀和剪刀，制作一个皮下隧道。

这三个切口将皮下组织、肌肉、神经和小血管分支全部切断。使用额外的锐性分离和钝性分离清理基底部，保留约5到10毫米宽的裸露软骨。出血可通过纱布压迫控制。

无需使用电灼。耳内皮肤不必切开，因其血供较少。本操作的关键在于充分分离皮下隧道的同时保护血管。

这本不应是一个过于复杂的操作。止血后，使用4-0或5-0缝线关闭三处皮肤切口，并再次检查，以确保皮肤切口已妥善闭合且无出血。对于伤口药物测试，可在每只耳朵腹侧用直径6毫米的不锈钢打孔器制备四个圆形全层皮肤伤口。

伤口之间的距离至少为20至30毫米。去除打孔内侧的皮肤和软骨膜，但不损伤软骨。双耳完成打孔后，暂时用纱布覆盖伤口，并将兔子转移至操作室进行药物处理。

清除伤口处的所有血凝块后，施用试验药物和对照药物。伤口覆盖闭塞性敷料以防止干燥。比较两种药物时，每种药物均应施用于近端和远端的伤口。

这可以控制术后耳部远端与近端伤口愈合速度的差异。缺血的耳部通常在切口远端出现发凉、发绀，并伴有感觉减退。轻度水肿可能持续数天，但会自行消退，无需特殊治疗。

中心动脉搏动消失。耳部活动减弱，但并未完全消失，因为部分肌肉仍附着在耳基部。如果隧道制作正确，切口之间可观察到清晰的凹陷。

为缓解可能的术后疼痛，将一片芬太尼贴剂贴于背部皮肤。每天使用体温计测量双耳的皮肤温度。使用经皮氧张力监测仪或激光多普勒血流仪测量耳部的血液循环。

术后一周，可拆除皮肤切口的缝线。该手术已在70多只兔子身上实施，其中包括23只糖尿病兔和4只老年兔。

非缺血耳与缺血耳之间的温度差异范围为1至10摄氏度，大多数兔子的差异在2至6摄氏度之间。术后早期温度差异较高，在第15天后逐渐降低，但在术后一个月末仍维持一定水平。每只耳采集六个组织样本，采用高效液相色谱法（HPLC）测定高能磷酸化合物含量，包括三磷酸腺苷（ATP）和总能量。

正常耳中的浓度高于缺血耳中的浓度。在15只非糖尿病兔中，无论是否患有糖尿病，缺血耳的伤口愈合时间均长于非缺血耳。非缺血耳的平均愈合时间为17.8天，而缺血耳的平均愈合时间为21.8天。

在10至12个月的糖尿病动物中，非缺血耳的平均愈合时间为18.3天，而缺血耳为29.1天。包括糖尿病兔在内的所有动物，其皮肤切口均正常愈合，未出现任何并发症。在糖尿病病程达24个月时，腹侧伤口更易发生感染。

这一特征使其更接近人类糖尿病伤口。组织学样本显示，皮下隧道在肌肉缺失并被纤维组织取代的情况下仍可愈合，但皮肤保持完整。

进行该操作时，重要的是要始终以人道的方式对待动物。掌握该技术后，可在一小时内完成操作。我们已在超过70只兔子中应用了该技术，其中包括23只糖尿病兔子，均未出现出血或感染等并发症。

遵循本方案进行操作是一种非常安全的程序。还可采用其他方法，如附加性缺血、神经损伤和细菌接种，以回答其他科学问题，例如血管性溃疡、压力性溃疡以及糖尿病性神经病变等。