一种用于缺血性肾损伤小鼠模型肾脏中 microRNA 定量检测的方法

microRNA 在急性肾损伤（AKI）中的表达改变可能对生物标志物和治疗具有重要意义。本方案操作简便，可在不同实验室之间获得稳定一致的结果。肾脏缺血再灌注损伤（IRI）是导致急性肾损伤（AKI）的主要危险因素之一。对 IRI 引起改变的 microRNA 进行定量分析有助于疾病诊断。从肾脏样本中纯化的 microRNA 可应用于其他系统。在整个操作过程中，需密切监测低体温、肠道湿润度以及麻醉深度。这是因为该操作涉及多种手动技术，需要熟练掌握。

[旁白] 确认小鼠对脚趾夹捏无反应后，将麻醉后的小鼠仰卧位放置于加热的手术垫上。沿腹部正中线做切口后，用 PBS 湿润的棉签轻轻将肠管推向腹腔外左侧，以暴露右侧肾脏和输尿管，并使用弯头镊子提起右侧输尿管。用 4-0 编织丝线在两个位置结扎输尿管，靠近肾脏侧的结扎线留得更长一些，然后在两结扎线之间剪断。小心持留下的结扎线，钝性分离沿肾脏走行的结缔组织和脂肪，识别一支非肾动脉或肾静脉、但为右肾供血的血管。结扎该血管，当右肾充分游离后，结扎肾静脉和肾动脉。用 PBS 湿润的棉签将肠管轻轻推向腹腔外右侧，暴露左肾，并用湿润的手术巾覆盖肠管。按上述方法准备左肾后，于距肾脏 1 厘米处夹闭肾动脉和肾静脉，以诱导左肾缺血。成功的缺血可通过肾脏组织逐渐均匀变暗在视觉上确认。确认缺血后，将肠管组织复位回腹腔，注意避免肠管扭转，并暂时关闭腹壁皮肤并覆盖手术巾。25 至 45 分钟后，移除夹闭夹，并确认血流再灌注及肾脏颜色改善。确认肠管无扭曲后，向腹腔内注射 PBS，然后使用 4-0 尼龙缝线分两层缝合腹肌和皮肤。在缺血损伤诱导后 24 小时，重新打开正中切口，使用 27 号针头从下腔静脉采集血液。在胸壁做正中切口，将 23 号针头插入左心室。确认针头内有回流血液后，在肝脏右叶做切口，并注入 20 毫升 PBS。肝脏颜色由红色变为粉红色，表明血液已充分排出。使用镊子和剪刀切除左肾，并将切除的组织置于 PBS 培养皿中清洗。然后用镊子去除肾筋膜，注意避免肾脏干燥，并沿垂直正中线将肾脏切成两半。为纯化 microRNA，取 30 毫克冷冻肾脏样本置于冰上装有 700 微升苯基胍类裂解试剂的玻璃匀浆器中，缓慢并反复旋转研杵，彻底匀浆样本。组织完全解离后，将匀浆裂解液转移至装有生物聚合物破碎系统的微量离心柱（置于 2 毫升收集管中），通过离心将样本收集至管底。将裂解液转移至另一含有 140 微升氯仿的新微量离心管中，盖紧管盖后颠倒混匀 15 秒。室温孵育 2 至 3 分钟后，离心沉淀样本，将上清液转移至另一新微量离心管中，其中加入 1.5 倍体积的 100% 乙醇，注意勿扰动沉淀。涡旋混匀 5 秒后，取 700 微升样本转移至基于二氧化硅膜的离心柱（置于 2 毫升收集管中）。短暂离心后弃去穿流液，每次使用 500 微升洗涤缓冲液 2，在新的二氧化硅膜离心柱中清洗样本两次，以去除任何残留盐分。第二次洗涤后，再次离心二氧化硅膜离心柱，弃去穿流液后将柱子转移至新的 1.5 毫升收集管中。向柱中加入 25 微升无 RNase 水，室温孵育 5 分钟后再次离心。然后将含 microRNA 的 25 微升洗脱液转移至新的微量离心管中。本研究探讨了在人类中表达且在急性肾损伤小鼠肾脏中上调的 7 种 microRNA。通过定量实时 PCR 分析发现，与假手术小鼠相比，缺血再灌注损伤小鼠肾脏中 6 种 microRNA 的水平显著升高。血清尿素氮和肌酐水平以及急性肾小管坏死程度也显著上调。

用于缺血再灌注损伤诊断和急性肾损伤特异性治疗的生物标志物仍不明确。我希望 microRNA 的研究能够取得进展，从而促进急性肾损伤的诊断与治疗。