固相亚单体合成肽模拟物聚合物及其自组装形成高度有序纳米片

本实验的总体目标是描述一种简单高效的固相多肽合成方法，以及多肽在水相中自组装形成高度有序纳米片层的过程。从结构上看，此类多肽与多肽类似，属于取代的甘氨酸聚合物，其侧链连接在氮原子上，而非α-碳原子上。该过程首先通过亚单体方法合成特定的多肽序列。

亚单体法包含两个简单的化学步骤，依次将每个单体引入链中。第一步，将连接在固相载体上的胺进行溴乙酰化。第二步，用伯胺取代溴离子。

重复这些步骤直至达到所需的链长。链延伸完成后，将肽从固相载体上裂解下来，所得的粗肽油通过高效液相色谱纯化，并进行表征，以启动肽向纳米片的自组装。在玻璃小瓶中配制肽的稀水缓冲溶液，并轻轻混合。作为最后一步。

在显微镜下观察纳米片。结果表明，通过两个简单化学步骤的迭代循环，可获得一种能自发自组装成纳米片的序列特异性聚合物。肽是一类新型的仿生聚合物，其性质介于蛋白质与传统聚合物之间。

它们像传统聚合物一样坚固且具有良好的合成可调性，同时也像蛋白质和DNA一样具有高度可调性和序列特异性。多肽正作为一种先进材料被用于解决生物医学和材料科学中的关键问题，例如生物活性药物的筛选或人工蛋白质的设计。多肽的主要优势包括精确的序列控制、种类极其丰富的构建单元、高效的合成过程以及对蛋白酶的稳定性。本文概述了一种通用的多肽手动合成方法，该方法仅需使用基本设备和市售试剂，可在大多数实验室中便捷地完成多肽的合成。

直观展示合成步骤至关重要，可为初涉固相合成领域的研究人员提供宝贵的参考。本文首次详细描述了两亲性肽（36个氨基酸残基）的纯化与表征过程，以及其自组装形成高度有序纳米片的特性。请首先按照书面实验方案中的说明搭建实验装置。

以下步骤将使用玻璃反应容器进行，而非一次性聚丙烯烧结柱，以便更清晰地展示操作过程。将100毫克R酰胺树脂加入烧结反应容器后，加入2毫升二甲基甲酰胺（DMF）溶胀树脂，并通过鼓泡搅拌10分钟。随后在真空条件下排去溶液，以分离溶胀后的树脂。

接下来，加入1 mL含20%三氟乙酸的DMF溶液以脱去FMOC保护基团。振荡2分钟，然后排尽溶液。重复此过程共12分钟，随后用2 mL DMF冲洗树脂，振荡15秒后排尽溶液。

从第一个亚单体循环开始生长肽链，该循环包括溴乙酰化和取代两个步骤。进行溴乙酰化时，加入1毫升0.6摩尔的溴乙酸DMF溶液和86微升二异丙基碳二亚胺。振荡反应30分钟后，排尽溶液，并用2毫升DMF冲洗。

接下来，加入一毫升浓度为一到二摩尔的端甲基吡咯酮胺进行置换，孵育30至120分钟。孵育结束后，排液并用两毫升DMF冲洗。随后，通过重复亚单体循环继续延长肽链。完成最后一次置换后，用两毫升DMF冲洗。

随后用一个二氧六环甲烷洗涤柱盖封闭，并将反应容器保存至进行裂解。开始裂解时，在通风橱内并佩戴适当的个人防护装备，将所有干燥的树脂转移至一个20毫升的闪烁玻璃小瓶中，加入4毫升三氟乙酸（TFA）裂解混合液至闪烁玻璃小瓶中，并盖上盖子。在室温下紧密搅拌10分钟至2小时。

或者，使用旋转摇床混合溶液。通过一次性聚丙烯烧结滤筒将树脂过滤，收集三氟乙酸（TFA）裂解液至一个新的已称重的20毫升闪烁玻璃小瓶中。接着，加入1毫升新鲜裂解试剂冲洗树脂，以收集残留的肽段。

重复此步骤，冲洗两次。通过吹入温和的氮气流或使用生物电荷装置蒸发三氟乙酸（TFA）。使用V 10蒸发仪，将粗产物溶于6毫升体积比为1:1的乙腈和水混合溶液中。

然后将样品冷冻并冻干。在第二次冻干后，应重复此过程一次。通过霉菌分析型HPLC和/或电喷雾LCMS联用，记录粗产物的重量，并将其作为干燥粉末在-20摄氏度下保存。

通过按照文中所述步骤操作，可确定粗产物的纯度以及是否含有目标分子量。随后可根据书面流程采用反相制备型高效液相色谱法（reverse phase prep HPLC）对粗肽混合物进行纯化。本部分描述了由单一链序列特异性两亲性36肽（36 me peptide）形成片层结构的实验方案。

多肽链合成、纯化并冻干后，将所得白色粉末溶解于DMSO中，配制成2毫摩尔的储备液。接着，取一个Dr.Glass文件，用于配制20微摩尔的多肽溶液。首先，加入445微升的Milli-Q水和50微升的10倍成膜缓冲液。

涡旋小瓶以混匀。然后加入5 µL的2 mM肽储备溶液，轻轻混匀。通过轻轻搅动稀释的水相肽溶液，形成片状结构。

将带盖的玻璃小瓶从水平位置缓慢倾斜至直立位置。此操作可实现轻微振荡，同样可得到片状产物。然而，对于许多高质量的片状物而言，所得片状物往往较小，且直边较少。

使用试管旋转仪或定制的摇床，将玻璃小瓶围绕水平轴缓慢旋转一天，以对纳米片进行荧光染色；向100微升纳米片溶液中加入1微升100微摩尔的尼罗红，使尼罗红的终浓度为1微摩尔。尼罗红是一种环境敏感性染料，当其位于疏水环境时，荧光强度会增强。接下来，将1%琼脂糖溶液溶于热水中，并倒入塑料培养皿中。

确保 aros 溶液厚度约为八分之一英寸，并将其静置在平坦表面上冷却。待 aros 凝固后，用刮刀切割成一厘米见方的小块。然后将切好的小块转移至载玻片上，在同一平面位置取一微升片层溶液滴加到 aros 样品上。

两分钟后，aros 应吸收缓冲液，使片层停留在表面。在15分钟内对片层进行成像。或者，若需对片层和溶液同时成像，可在载玻片上直径为20毫米、厚度为0.12毫米的垫圈内加入15微升溶液。

用盖玻片覆盖样品，并在几天内完成成像，以进行纳米片的扫描电镜观察。首先对硅片进行等离子体刻蚀，以促进纳米片的吸附。然后将20 µL的肽纳米片溶液滴加到经等离子体处理的硅基底上，静置3分钟后，用Kimwipe的尖端吸除多余溶液，再向表面滴加20 µL水，再次吸除多余液体，以去除缓冲液和盐分。

或者，将肽片溶液对水进行透析，以去除缓冲液和盐分。在此情况下，可将20微升透析后的片状溶液滴加到经等离子体处理的硅基底上，并使其自然风干。待片状溶液在经等离子体处理的硅基底上完全干燥后，可使用镜内检测器在1千伏至5千伏的电子束能量下通过扫描电镜（SEM）对样品进行成像。

对一种具有序列特异性的36个残基的嵌段电荷肽进行了合成、表征与纯化，该肽可折叠形成高度有序的二维纳米片。在合成该36残基嵌段电荷肽时，所用的胺类包括乙二胺、苯乙胺和叔丁基-β-丙氨酸。合成完成后，粗肽通过95%的水性三氟乙酸（TFA）从树脂上裂解下来。

收集并蒸发三氟乙酸溶液后，通过反相高效液相色谱纯化粗制的36个甲硫氨酸区段电荷肽。随后通过质谱法确认纯化后区段电荷肽的分子量。

观测到的质量数4981.2与计算值4981.74非常接近。将冻干粉末溶解于DMSO中，配制成2毫摩尔的储备液，并在4°C下保存。按照前述方案制备样品片，并使用荧光光学显微镜进行成像。

观察到多种形状，其特征尺寸最大可达 300 微米，并且显著的直边十分明显。扫描电镜（SEM）也用于对这些片层进行成像，同样显示出明显的直边。本视频介绍了一种简单高效的固相合成多肽及其在水相中自组装形成纳米片层的实验方案。

由于有数百种氨基酸基本单元可直接获得并可用于本方案，多肽所能实现的设计空间实际上几乎是无限的。肽类因其合成灵活性、稳定性和有序性，成为生物医学和纳米科学研究中极具前景的材料。特别是在原子水平上，这些纳米片可作为二维展示支架、膜模拟物、生物传感器、蛋白质模拟物以及器件制备的潜在平台。

操作三溴化磷、乙酸和溴乙酸等腐蚀性试剂具有极高危险性，为防止受伤，所有反应均应在通风橱中进行，并穿戴适当的个人防护装备。