用于医疗器械的细菌排斥聚合物高通量筛选

该聚合物微阵列技术的总体目标是鉴定出能够调控细菌在非生物表面附着的合成聚合物。该方法有助于加快发现简单且具有成本效益的生物材料，以抑制细菌在医疗器械上的附着。与传统生物材料研究中一次仅测试一种材料的方法相比，该技术的主要优势在于能够在单次实验中同时筛选数百种聚合物。

首先，根据文本方案制备聚合物溶液，并将其加入384孔板的孔中。创建一个打印程序，以四重复方式打印聚合物，共1536个点，排列为48行×32列，每次打印32种聚合物溶液，以便在每部分打印完成后暂停打印机，对针头进行清洗。现在将涂有琼脂糖的载玻片放置于平台上，并确保形成良好的真空密封，以固定载玻片位置。

为调整打印头使所有针尖处于同一高度，手动将打印头降下接触载玻片，并确认所有针尖同时向上移动。将孔板放置在板架上，使A1孔位于板架的右上角，并确保孔板牢固固定。当系统提示时，确认载玻片和孔板已正确就位。

一次打印一个区域，以便在区域之间清洁针头。然后用浸有丙酮的纸巾彻底清洁针头，再用干燥的纸巾擦拭，确保针头完全干燥。

微阵列完全打印完成后，将其放入载玻片架中，并转移至设定为40摄氏度的真空烘箱中干燥，以去除聚合物点样中的N&P。然后使用紫外光对载玻片进行30分钟的灭菌处理。在用细菌接种载玻片之前，根据文本方案测量背景荧光值。

根据文本方案培养并制备微阵列的接种物后，将经紫外线灭菌的聚合物微阵列放入矩形四孔板中，并加入六毫升混合细菌培养物。在37摄氏度下轻柔振荡培养五天。培养结束后，用PBS轻轻冲洗微阵列两次。

然后在 PBS 中加入终浓度为每毫升 1 微克的 DAPI，孵育 30 分钟。接着将微阵列转移至新的四孔板中，用 PBS 覆盖微阵列后轻轻振荡。随后更换一次 PBS，并重复洗涤步骤。

清洗后，在气流下干燥微阵列，然后贴上密封膜，并将玻璃盖玻片固定到微阵列载玻片上。待胶水干燥后，使用70%乙醇对外表面进行消毒。使用配备20倍物镜的荧光显微镜，在明场和strappy通道中分别采集每个聚合物点的单张图像。

为了用聚合物涂覆盖玻片，需在四氢呋喃或其他合适的溶剂中配制HIT聚合物溶液。使用旋涂仪，以2000 RPM的转速将适当尺寸的圆形玻璃盖玻片旋涂聚合物溶液，持续10秒。将涂覆后的盖玻片置于40摄氏度的对流烘箱中过夜干燥。

在接种细菌前，使用紫外光对盖玻片灭菌30分钟。将经紫外灭菌的盖玻片放入标准的12孔或24孔板中，并按照本视频前面演示的方法与细菌共孵育。孵育结束后，先用0.1 mol/L的卡可基酸缓冲液洗涤包被的盖玻片两次，然后用2.5%（质量/体积）戊二醛与0.1 mol/L卡可基酸缓冲液混合液固定样品2小时。

在室温下用1%四氧化锇固定盖玻片1小时。随后将样品依次在乙醇梯度溶液中脱水，每个浓度处理30分钟。然后使用溅射镀膜仪，在0.75托的真空度和30毫安电流条件下，以60至40%的金铂合金对样品进行镀膜。

使用扫描电镜（SEM）成像后，通过视觉比较未包被盖玻片与包被有琼脂糖或HIT聚合物的盖玻片图像，以确认聚合物对细菌的结合或排斥能力。为评估不同溶剂与导管末端膨胀部分的相容性及其溶解HIT聚合物的能力，将导管片段浸入溶剂中，孵育12小时，随后通过肉眼观察导管的完整性及溶剂的澄清度。为通过扫描电镜分析导管上细菌的附着情况，需用丙酮配制10%的聚合物溶液。

将200微升微量移液器吸头压入导管切段的中段以固定导管，然后将导管段浸入聚合物溶液中约30秒。在常温条件下干燥涂覆后的导管段30分钟，然后通过再次将导管段浸入聚合物溶液中进行第二次涂覆，并在常温条件下过夜干燥。根据文本方案，将涂覆与未涂覆的导管段在接种的LB培养基中孵育后，使用1毫升PBS冲洗导管。

然后使用 PBS 中的 10% 多聚甲醛固定细菌 30 分钟。用 PBS 洗涤后，使用 DAPI 对导管片段上的细菌染色 20 分钟。再用一毫升 PBS 洗涤。

观察样品在腔室中的排列情况。使用以下设置，对导管片段进行共聚焦成像。通过在导管100微米长度范围内进行50层z轴堆叠，完成共聚焦成像。

经过紫外线处理并与细菌孵育后，使用一毫升 PBS 溶液清洗材料片两次，然后将其转移至含有 PBS 配制的 10% 甲醛溶液的 48 孔板中，固定 30 分钟。样品固定后，再次用 PBS 洗涤，并在室温下过夜干燥。随后使用导电碳片将样品固定在样品台上，并用溅射镀膜仪进行镀金处理。

成像前，使用扫描电子显微镜。该图显示了通过微阵列分析确定的细菌对多种聚合物的黏附情况。未打印聚合物的点作为阴性对照，因为琼脂糖强烈抵抗细菌结合，因此荧光信号非常低。

所展示的聚合物具有合金结合特性，尽管在大多数情况下，不同测试菌种间聚合物的抗污性能存在显著差异。这反映了不同菌种之间附着机制的广泛差异。通过与琼脂糖比较，可轻松识别低结合聚合物。

高结合性聚合物可能在阵列中被鉴定出来，并可作为后续实验的阳性对照。对于在DAPI通道中不显示自发荧光的聚合物，可通过肉眼直观比较点样图像进行定性分析。为验证所鉴定出的22种合适聚合物的抗细菌黏附特性，已开展放大实验以测试大面积表面涂层的效果。

此处显示的是通过扫描电镜（SEM）分析确定的用于包被玻璃盖玻片的最佳性能样品。这些图像展示了通过共聚焦显微镜和扫描电镜（SEM）分析的导管切片。这两种显微技术的优势在于能够直接对表面进行细胞计数，从而提供明确的数据，因为细胞黏附的减少可被清晰观察到。

采用此方案后，可检测血清或血液成分，以确定其对细菌结合的影响。可使用动物模型来评估聚合物涂层在临床应用中的潜力。请注意，操作化学品和病原生物可能存在危险。

在处理和处置过程中，应采取必要的控制措施，以降低对个人和环境的风险。