利用固态纳米孔监测蛋白质吸附

本实验的总体目标是制备用于蛋白质吸附研究的人工膜纳米孔。该过程通过使用扫描透射电子显微镜（STEM）在氮化物膜上钻取纳米孔来实现。随后将含有纳米孔的膜装入样品室，并用离子溶液润湿。

使液体在纳米孔的一侧与另一侧之间形成液桥，从而使纳米孔准备好进行实验。在两端施加电压后，可观察到离子电流通过纳米孔。最后一步是在纳米孔腔室中加入蛋白质。

最终观察到纳米孔道中离子电流的长寿命阻断现象，揭示了蛋白质吸附在纳米孔侧壁上的过程。大家好，我是 Dave Wicki，雪城大学物理系的一名研究生。

尽管该方法可用于研究蛋白质在无机表面的吸附行为，也可应用于其他体系，如蛋白质与核酸相互作用、单分子光谱学以及受限空间内分子的研究。首先将STEM调至加速电压。

接下来，将一块带有硅氮化物窗口的SPI网格装入透射电子显微镜（TEM）样品 holder 中。使用氧气等离子体对网格进行30秒的清洁，以去除表面污染物。在装入样品前，先将样品 holder 装入TEM中，并等待真空系统抽至工作真空度。

使用明场透射电子显微镜（TEM）模式，找到氮化物窗口，即原始图像上的一个明亮方形区域。确保透射电子显微镜已正确对中，然后对样品进行对中和聚焦。

现在将系统切换至STEM模式，并使用明场探测器对样品成像以检查其对中情况。如有单色器，将其设置为较低值，以获得更高的电子束电流用于钻孔。根据电子探针的直径选择合适的束斑尺寸，以进行纳米孔钻孔。

保持样品杆对齐。使用BROGRAM在所需放大倍数下精确聚焦氮化硅膜。若样品有任何移动，请消散电子束，等待样品稳定后再继续操作。

这可能需要长达一小时。一旦稳定，将电子探针置于样品上并开始钻制纳米孔。使用透射电镜（TM）钻制纳米孔需要极大的耐心。

这是一种氮化物在电子束探针作用下逐渐消散的过程。需保持电子探针始终位于钻孔位置正上方，并确认纳米孔已完全钻通。在将样品从透射电镜中取出之前，应使用高角度环形暗场探测器定期扫描检查样品。

如果样品发生轻微漂移，应调整电子探针的位置，使其对准纳米孔。当ROI图清晰聚焦时，氮化膜的闪烁现象将消失。当纳米孔形成且ROKY图失焦时，可观察到 fray nail 条纹。

关闭加热后对纳米孔成像，并对图像生成强度分布曲线。可通过该曲线中最暗区域估算纳米孔的直径。如有需要，可使用电子束扩大纳米孔。

当达到所需直径时，将单色器调至标准设置，切换至透射电子显微镜（TEM）模式。采用明场透射电子显微镜观察以确认孔径大小。

首先准备脱气的生理盐水。将溶液置于真空环境中，并在水浴中超声处理20分钟。小心地将含有氮化硅芯片的脆弱纳米孔放入一个10毫升的派热克斯烧杯中。然后在通风橱内，将烧杯放置在加热板上。

使用食人鱼溶液非常小心地清洗纳米孔芯片。首先，用玻璃移液管向容器中加入三毫升硫酸。其次，小心地向硫酸中加入一毫升高浓度过氧化氢。

请采取所有预防措施。让纳米孔芯片浸泡10分钟。然后使用玻璃移液管从烧杯中移除芬顿溶液，并妥善处理。

接下来，用脱气去离子水注满烧杯。使用一支洁净的玻璃移液管，将烧杯中的水排空，并重复此清洗步骤至少五次。用洁净的镊子取出纳米孔芯片，并通过轻微抽吸使其干燥。

干燥后，立即将纳米孔芯片密封到腔室中。可通过O型圈或硅胶密封剂将芯片固定在腔室内。向腔室中加入氯化钾溶液。

将银-氯化银电极连接到腔室。可通过将银丝浸泡在漂白剂中过夜来制备电极。在电极两端施加跨膜电位，并使用膜片钳放大器监测电流响应。

在电压钳模式下，根据测量结果绘制电流-电压曲线。该曲线应具有高度线性。当使用一摩尔氯化钾时，纳米孔的电导应与其直径相对应。

如果纳米孔未显示出线性IV曲线，电导过低或纳米孔的开放电流不稳定，则表明纳米孔未正确形成，应重复piha清洗步骤。确保液体存在于纳米孔内部至关重要。

如果此步骤操作不当，纳米孔中的离子电流将表现出极大的噪声，且蛋白质进入纳米孔的分配会显著减少。首先，将目标蛋白的纯化样品加入到腔室的接地浴液中，等待样品充分扩散。

施加一个跨膜电势偏压，其极性与所研究蛋白质的总电荷相反。施加200毫伏的电势应足以产生可观测信号。大多数蛋白质分析物事件将表现为相对于基线的瞬时电流偏转。

若未观察到信号，可增加样品室中蛋白质的浓度。较高的电压可改善信噪比和氮化层性能。纳米孔能够耐受数伏电压。

蛋白质的结合将表现为纳米孔基线电流的长时程变化。固态纳米孔的典型结果如下：开放孔道电流应具有高度稳定性。

纳米孔的电流-电压（IV）特性应具有高度线性。在1摩尔氯化钾、10摩尔磷酸钾（pH 7.4）溶液中，对IV曲线进行线性拟合所得的斜率即为纳米孔的单通道电导率。电导率与纳米孔直径呈直接关系，且应符合该方程。

该值应在30%以内相符。如果该值过小，则表明孔道可能未成功结合蛋白。快速事件应紧随蛋白吸附之后发生，表现为持续较长时间的电流下降。某些蛋白质具有高度不稳定性，会在孔道内部发生结构转变。

在这种情况下，长时间存在的电压降将伴随快速波动。观看本视频后，您应充分了解如何使用扫描透射电子显微镜制备固态纳米孔，并利用这些处于适当状态的SA蛋白进行吸附。请务必注意，使用piranha溶液具有极高危险性，在进行该操作时，必须采取预防措施，例如在通风橱中操作，并佩戴手套、实验服和化学防护围裙。

感谢观看，祝您的实验顺利。