质谱流式细胞术：在CyTOF质谱流式细胞仪上进行日常校准与细胞样本检测的操作方案

本实验流程的主要目标是演示如何在CyTOF仪器上进行正确的日常校准及样品分析。首先，组装仪器并开机。随后，优化仪器参数设置，使调谐信号达到最大值。

此时，仪器已准备就绪，可开始运行样品。最后一步是清洁仪器并关闭电源。最终，可根据特定的时间要求获取最佳的细胞数据。

该技术的可视化演示至关重要。日常的设置、调试和清洁程序难以仅通过手册学习，因为涉及多个同时进行的软件操作步骤。

您需要积累经验，以掌握适当的背景水平和信号强度。在开始实验前至少15分钟，打开CyTOF软件程序并选择仪器设置。然后在卡笼选项卡中，单击加热器开启按钮，使喷雾室外套温度升至200摄氏度。

将注射泵中的注射器更换为装有超纯水的新注射器。然后通过每个端口用5%柠檬酸反向冲洗雾化器两次，以清洗雾化器。为去除残留的柠檬酸，再用超纯水重复反向冲洗。

接下来，打开氩气瓶阀门，使仪器前面的氩气指示灯亮起。然后将雾化器连接至载气入口，并将雾化器连接至液体进样管路。将雾化器末端插入仪器设置窗口中RFG控制器标签页上加热套上的白色开口处。

单击“启动等离子体”，然后单击“确定”。启动完成后，在弹出窗口中再次单击“确定”。现在打开注射泵。

重新填充注射器时，应按下停止按钮而非暂停按钮，以重置体积计数器。在校准质谱流式细胞仪之前，确保仪器已预热20分钟。待仪器稳定后，单击采集设置按钮，打开数据采集设置窗口。在分析物选项卡中。

单击元素周期表以打开同位素选择面板。然后在手册列出的 DVS Sciences 调谐溶液中选择相应的同位素，然后单击保存。接着，单击每次读数的同位素按钮，以打开每次读数的质量窗口。

选择脉冲次数，并通过输入新数值后按回车键重新调整 y 轴刻度。现在，用一毫升绿色标准注射器吸取调谐溶液。将样品进样口选择阀转至“加载”位置。

注入450微升调谐溶液，然后将选择器转至注入位置。等待调谐溶液的同位素在此显示中开始以条带形式出现。飞行时间9,400至9,800区域内的信号来源于氩气中的氙同位素。

现在返回到每次读数的质量窗口，然后点击绿色播放按钮。每条彩色线条代表来自分析物选项卡中选定的同位素。当同位素信号水平稳定后，在数据采集设置窗口的参数选项卡中，从下拉菜单选择当前调谐电流。

在起始窗口中，将“结束”设为0，输入10；步长值输入0.5，稳定时间输入200。然后点击保存。

然后返回“每次读数的质量”窗口并点击播放。记录下同位素信号峰值位置后，进入仪器设置窗口的 DAC 通道设置选项卡。向下滚动至电流项，并输入同位素峰值数值。

单击设置实际电流值，然后保存。接下来，更改下拉菜单为配气模式。在起始窗口中输入 0.55，在结束窗口中输入 0.95，在步长值窗口中输入 0.05，在稳定时间窗口中输入 200。

单击保存。返回“每次读数的质量”窗口并再次单击播放后，x 轴将显示载气流速。注意同位素信号达到峰值时的数值，并观察 GD 1 55 信号在末段附近的快速上升。

然后返回到 DAC 通道设置选项卡。向下滚动至补妆气（makeup gas）部分，输入新的同位素峰数值，然后点击“设置实际当前值”。

然后再次点击保存，以记录目标同位素与氧化物的比值。首先，进行第二次450微升调谐溶液进样。接着，在参数选项卡中，从下拉菜单选择“时间”，在起始窗口输入0，在结束窗口输入10，在步长值窗口输入1，在稳定时间窗口输入200。

在质量读数窗口中点击播放后，使用光标读取 TM 1 69 或 TB 1 59 的较高值，同时读取 GD 1 55 的数值。随后，通过样品环注入三毫升 Milli Q 水，接着注入 500 微升 DVS 清洗液。在质量校准选项卡中，点击运行以监测清洗过程的进展，直至条带强度开始下降。

然后加入三毫升的milliQ水，并监测直至条带降至背景水平。首先输入刚刚针对调谐溶液同位素所演示的样品同位素，然后点击保存。接下来，打开采集窗口，并根据样品体积的需要调整采集参数。

例如，450 微升的样本将充满样本环路，运行需要 600 秒，以允许细胞数据采集过程中的延迟。运行前，将采集延迟设置为至少 30 秒，检测器稳定延迟设置为至少 20 秒。使用 Milli-Q 水将细胞样本清洗至少两次，然后将样本重悬于最大浓度为每毫升 10 的 6 次方个细胞的溶液中，并通过 35 微米细胞筛过滤所得细胞悬液。

为去除任何聚集体。现在为当前样品输入新的文件名。请注意，所有文件必须保存到 E 盘。

然后将样品环阀门切换至加载位置，注入样品，再将样品环阀门切换回注入位置，随后点击运行。在采集窗口中，细胞将以每个垂直同位素通道中水平排列的信号标记形式显示，并在每秒300至500个细胞的范围内表现出最佳分辨率，如此处所示。

当样品的数据采集完成后，将弹出一个窗口。单击“确定”以确认样品运行结束，随后在每个样品之间注入至少 500 µL 的超纯水，以尽量减少样品间的残留，清洁仪器。使用后，向样品环中注入 450 µL 的清洗液。监测游离金属的释放情况，然后用 3 mL 的超纯水冲洗样品环，并持续监测清洗过程，直至达到背景本底水平。

然后关闭仪器，选择仪器设置窗口中的 RFG 控制器选项卡，点击停止等离子体。当程序完成后，在弹出窗口中点击“确定”，建议在卡笼选项卡下移除雾化器。关闭加热器，关闭氩气供应管路上的阀门，然后小心地向后拉动雾化器，将其从喷雾室中取出。

接下来，拧下样品引入管路并将其放置一旁。拧松辅助气体引入接口直至略微松动，然后取下雾化器。最后，使用之前演示过的同一支注射器和管路，用5% Citron溶液清洗雾化器的两个端口，并将雾化器浸泡在5% Citron溶液中保存，直至下次使用。

使用超纯水（UE water）和 DVS 清洗液对质谱流式细胞仪进行充分清洗，可降低金属在管路及其他部件上的吸附，从而减少如图中所示的背景信号。如品红色线所示，调谐不当会显著增加质荷比 m+16 处的氧化物形成，与深蓝色线代表的正确调谐样本相比，这会导致目标信号 m 处的强度轻微下降，同时在 m+16 处显著增加非特异性背景干扰。

使用超纯水对样本进行充分清洗和适当稀释，可在保证实验速度的同时，最大限度地降低背景信号并获得最佳的细胞分辨率。在本实验中，与此处所示代表性实验数据类似，采用细胞采集模式检测了含有天然丰度的镧-139、钠-140、铽-159、镝-169和镥-175的聚苯乙烯微球。数据使用FlowJo软件进行分析，并设门排除破碎微球产生的碎片干扰。

经正确调谐的样品确定在 0.74 升/分钟的流速下，如深蓝色线所示。在此流速下观察到的信号强度高于较低流速下的信号强度，并且与未正确调谐的信号相比，该正确调谐的样品在 M 金属质量处的信号更高，而在 m+16 氧化物质量处的信号更低。此处展示了镧 139 和铥 169 处信号的放大图。

请注意，载气流速对镧 139 信号强度的影响大于对铥 169 信号强度的影响。这些图显示了 m+16 氧化物质量数 155 和 180.5 处的信号，分别对应于镧 139 加 OH 16 和铥 169 加 OH 16 的氧化物。请注意，随着载气流速的增加，质量数 155 的信号增强程度明显高于质量数 180.5 的信号，因为镧 139 比铥 169 更容易被氧化。

此处展示了信号强度 m 及 m+16 随载气流速变化的关系。实心图标代表质量为 M 的信号，空心图标代表质量为 M+16 的信号，线条颜色对应相应的质量 M。请注意，镧-139 和镨-141 的信号强度受载气流速影响显著，甚至在某些条件下，M+16 氧化物的信号强度超过质量为 M 的信号强度。观看本视频后，您应能够充分掌握 CyTOF 仪器的正确启动、优化调谐、样本运行，以及每日实验结束后的彻底清洗与关机操作。