通过多靶点追踪技术（MTT）绘制质膜分子扩散图谱

您好。在本视频中，我们将展示一个完整的单量子点追踪实验。该实验所用的专用算法是与图像ISIS专家合作完全设计开发的。在本视频中，我们将以表皮生长因子受体作为模型，来描述该技术的方法。

表皮生长因子受体是一种跨膜蛋白。该受体将使用单克隆抗体进行标记，该单克隆抗体被还原以仅保留A a B片段。A a B片段被生物素化，随后与量子点的链霉亲和素结合，该壁系统将精确识别EGF受体。

我们的目标是全面揭示细胞表面受体的动态行为。事实上，分子的运动轨迹可能偏离布朗扩散，被限制在纳米结构域内。例如，这可能是分子与信号伴侣或分子支架等相互作用的特征表现。

我们的目标是通过在细胞范围内对这些事件进行系统性绘图，从而对其进行全面描述，这需要在高SPECT时间分辨率的同时实现高标记密度。因此，我们将该方法命名为多靶点示踪。实验的第一步是样品的制备。

我们在无抗生素条件下培养活细胞。此处我们使用了七种成本细胞，这些细胞内源性表达EGF受体。在消化脱离细胞后，需要精确计数，以确保每个孔板中的细胞数量一致。

精确的细胞数量对于提高每细胞所含量子点数量的可预测性非常重要。将细胞接种到96孔板后，需在37°C、含7% CO2的条件下孵育24小时。下一步是制备与抗体偶联的量子点。量子点是一种微小的荧光纳米颗粒。

这些颗粒在此具有极大的应用价值，因为与传统的荧光探针和信号相比，它们具有更高的亮度和稳定性。信噪比对于此类实验极为重要。在此情况下，我们使用完全培养基来饱和量子点周围的疏水区域，防止其发生聚集。

随后，我们将量子点与生物素标记的蛋白质或抗体以一对一的比例结合，以确保统计学上获得更多的单价量子点。在本实验中，我们使用实验室制备的针对表皮生长因子受体（EGF receptor）的单克隆抗体衍生的Fab片段，该片段经生物素标记。在约15分钟的孵育过程中，可将样品置于摇床中，以每分钟1,200转和25°C的条件保持对照组的聚集状态和均一性。

当混合液准备好后，即可将其加入细胞中。从孔中轻轻移除培养基，以防止细胞在实验操作过程中脱落，并加入实验所需的混合液体积。本实验中，每孔加入 100 µL 混合液。

加入混合液后，可将细胞孵育15分钟，孵育条件为37摄氏度、7% CO2。孵育结束后，可在培养基悬浮液中观察到大量频繁出现的成对小点。

这些量子点应在成像前去除，因为它们会引入噪声。这就是为什么我们需要对每个样品进行多次洗涤，本实验中为五次洗涤。

使用无自发荧光的成像培养基。此处我们使用含有aps的HBSS缓冲液。现在您的细胞已准备就绪。

现在开始进行采集设置。该设置包含四个主要部分：一台倒置显微镜、一个具有眼敏感度的相机、一个高功率汞灯，以及一个用于将细胞维持在37摄氏度的培养箱。来自汞灯的光线通过光纤和滤光轮后，再照射到样品上。

样品的荧光信号经过滤光后，由左侧的EMCCD相机进行采集。目前我们使用的物镜数值孔径分别为1.3和1.49的油浸物镜。本实验的核心步骤是信号的采集过程本身。

当细胞处于焦点后，我们选择一个标记明显的代表性细胞进行观察。对于量子点，我们首先在透射白光下采集单张图像，可用于进一步检查细胞形态以及LA伪足的特定边界。随后，我们通常以36毫秒的速率采集视频，这是全帧模式下允许的最快速率。

我们采用电子倍增CCD，在信号与噪声比至少达到20分贝（通常约为25分贝）的条件下实现单分子灵敏度。通常情况下，我们会采集300帧图像。为了评估给定的数据集，您只需提供包含视频文件的目录路径即可。

然后输入命令，文本将在MetLab中重新连接，或使用命令MTT 23 I，该命令首先显示一个图形界面列表。所有使用的参数将启动全自动分析。核心的MTT分析将在每一帧上执行，调用三个主要任务：首先是针对每个像素检测目标量子亏损的存在与否。

然后对每个检测到的目标估计其相关参数，例如像素位置、信号强度等。最后，基于前几帧已建立的轨迹，重新连接新检测到的目标。

针对局部子区域，我们比较两种假设：仅有噪声或存在信号。利用点扩散函数，ModuLite 具有一个尖峰。我们采用一个阈值，以确保每帧中每个检测目标的误报率低于一次，从而实现足够低的虚警概率。

接下来，我们执行最小二乘伪营养物拟合，以估计所检测到的戈申（Goshen）的位置、宽度和高度。该方法可显著提供染料的尖峰细胞位置，通常在典型信噪比条件下，其精度可达10至20纳米。在高密度峰的情况下，峰之间往往过于接近，强峰可能会掩盖弱峰。为解决这一问题，我们从初始图像中扣除已检测到的峰信号。

同样，对残差的检测通常可重新校正约10%的峰。实现近乎穷尽的检测对于精确的重新连接非常有益。随后，将该瞳孔的新目标集与先前的轨迹集进行匹配。

为了在可能的情况下将每条轨迹分配给相应的目标，并处理可能发生的闪烁现象，我们会利用检测步骤中获得的所有可用统计信息。因此，目标的分配并非仅仅依据最近邻原则。当出现轨迹交叉等冲突情况，即各自相关研究区域发生重叠时，我们将综合考虑轨迹和目标在强度、速度、宽度以及闪烁特性方面的统计值。

这将提供统计学上最优的重连分数。该策略允许尽可能避免将重连偏向最近邻，即最慢的运动。接下来，我们使用一个函数来评估轨迹中可能存在的瞬时束缚状态。

该功能与 Sexton Simpson 及其合作者所确立的局部扩散呈反比关系。通过设定阈值，可界定受限或非受限时段。通过对整个轨迹进行迭代，最终可将膜动力学特征映射为瞬时受限、运动减缓的证据，并加以呈现。

或者，利用该限制性指数的二进制或离散值，默认情况下，MTT 将自动执行这些任务，为每个视频在 eski 文件中保存每个峰的行参数，以供进一步的高级分析。典型结果包括覆盖于每个细胞上的轨迹图，以及感兴趣参数的直方图，如峰强度、信噪比、局部缺陷值等，因此该方法也可轻松适配于任何特定的研究需求。本视频将总结 MTT 获得的典型结果。

大部分工作在于设计算法，该算法可能需要根据特定的研究需求（如运动模式或相互作用）进行调整。但运行 MTT 非常简单直接，用户只需优化少数几个参数，例如空间和时间限制。

在设计 MTT 时，我们的目标是彻底重新考虑每项任务所采用的分析方法。我们沿着两个具有挑战性的方向对流程进行了优化：首先，应对高密度情况，以在表面获取最佳的空间信息；其次，处理低信噪比（SNR）条件，这种情况通常允许在低消除水平下工作，而高速限制可被解释为潜在相互作用的特征表现。

膜受体可能会与膜下细胞骨架或富含脂质的区域相互作用。此类事件可通过空间和时间上的限制性变化进行研究。动态测量结果可与荧光弛豫各向异性（FRA F Cs）或漂移等互补方法进行比较。

开源代码可供学术研究使用。可从我们团队页面上的 CML dot univ if an S fr 网站下载，该页面提供了下载链接。也欢迎有意向的企业界人士与我们联系。

我们特别感谢团队成员及公共设施部门成员提供的支持与富有成效的讨论。本项目由法国国家科学研究中心（CNRS）在太平洋地区国家拉大学的MAA项目资助，医学基金会由联赛管理机构支持。感谢观看。