坏死性凋亡中MLKL介导的质膜破裂的表征

这些方法有助于解答关于假激酶混合谱系激酶样蛋白（MLKL）在坏死性凋亡中作用的关键问题，例如其在脂质结合过程中的膜转位和通透化。这些技术的主要优势在于能够直接证明MLKL是坏死性凋亡中细胞膜破裂的执行者。活细胞成像技术彻底改变了细胞死亡研究领域，尤其推动了MLKL介导的坏死性凋亡研究。

核磁共振是一种强大的技术，可用于监测脂质与蛋白质的结合，本文以MLKL为例进行了演示。首先，在24孔板中每孔加入1毫升添加了补剂的DMEM培养基，并接种5×10⁴个表达MLKL执行结构域（与寡聚化盒及Venus蛋白融合）的MLKL基因敲除小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs），每孔接种一次，置于细胞培养箱中过夜培养。次日早晨，用多西环素处理细胞12小时以诱导转基因表达，随后加入补充了FK506结合蛋白二聚化试剂和细胞膜非通透性绿色荧光染料的标准DMEM培养基，以诱导细胞发生坏死性凋亡。

为了监测细胞死亡，将培养板放入位于哺乳动物组织培养箱内的合适成像设备中，并打开成像系统软件。选择“计划 upcoming 扫描”选项卡，在“物理布局”选项卡中选择托盘、容器、扫描类型和扫描模式。在“属性”选项卡中选择快速荧光，然后点击“时间线”窗口，设置总时间点数量和采集频率，以添加扫描时间。

然后，点击“应用”以开始图像采集。为了定量分析坏死性凋亡，选择“任务”面板，将鼠标悬停在多张图像的背景区域，以在背景信号水平之上设置具有固定分割阈值的物体计数新分析。接着，选择“预览”以检查当前图像中的荧光物体，并根据需要优化阈值水平。

可通过观察孔板上的多个孔并使用软件中的预览功能，仔细选择阈值。请注意，孔板中所有孔的阈值设置应保持一致。为整合绿色荧光计数，在“启动新分析”选项卡下选择时间范围和待分析的孔，并输入分析任务名称。

然后，单击“确定”，并双击作业名称，将数据导出至适当的绘图软件中进行进一步分析。对于通过核磁共振波谱法（NMR）检测MLKL与脂质的结合，应使用密封的注射器将目标磷脂以每毫升一毫克的浓度分装至洁净的玻璃小瓶中，用于单独的NMR滴定实验，并将小瓶置于氩气或氮气气流下吹扫五到三十分钟。从氯仿或甲醇等挥发性溶剂中分装脂质时，必须迅速操作，且脂质储备液需保存在干冰上，以尽量减少因溶剂挥发而导致样品间脂质浓度不一致的情况。

蒸发结束后，使用大号镊子将小瓶置于布氏烧瓶底部。用橡胶塞密封烧瓶，并连接连接至真空管线的塑料管，在温和真空条件下抽气过夜，以除去残留的有机溶剂。次日早晨，向每支含有脂质膜的玻璃小瓶中加入含有去垢剂的核磁共振缓冲液，使其达到适当的实验浓度，随后将小瓶置于水浴中超声处理最多30分钟，每10分钟停止一次超声，检查脂质膜的溶解情况。

超声处理结束后，让样品管静置冷却15分钟，然后在含去垢剂的NMR缓冲液中对脂质-去垢剂胶束进行系列稀释，将1:1混合物超声处理以获得所需浓度梯度。分别在不含去垢剂和含去垢剂的NMR缓冲液中制备蛋白质及添加剂的对照和参考NMR样品，并将蛋白质和添加剂分别加入含去垢剂缓冲液中的各脂质稀释样品中。随后，将适量样品转移至合适尺寸的NMR样品管中，并将样品装载到NMR仪器上进行检测。

在表达融合转基因的细胞经多西环素预孵育后，通过二聚体介导的寡聚化，可在一小时内观察到MLKL基因敲除的小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）发生完全的坏死性凋亡。这种快速动力学的坏死性凋亡支持MLKL作为质膜破裂假定执行者的角色：在加入二聚体后一至两分钟内，即可观察到与质膜相关的Venus荧光点状结构，细胞周边出现Venus信号；两至三分钟内，细胞逐渐变圆。在快速坏死性凋亡过程中，细胞形态在寡聚化后五分钟内即从正常的细长形转变为圆形并肿胀，10分钟时出现部分破裂，20分钟时细胞结构广泛解体，胞质消失。

通过核磁共振波谱监测的体外脂质结合实验揭示了MLKL效应结构域蛋白在结合脂质后发生的显著结构变化：脂质结合导致抑制性支架区域从闭合的N端螺旋构象转变为开放且内在无序的构象，同时可获得两种构象混合物中各个残基的详细信息。在特定样品中，闭合与开放构象所占的百分比亦可被监测，从而为MLKL效应结构域与磷脂的相互作用提供支持性证据，并提示MLKL与质膜之间存在直接关联。因此，在尝试利用该方法定量细胞死亡时，必须清楚并牢记：DNA结合染料的荧光阈值高于通常使用的基因编码荧光蛋白。

因此，这些方法可以并行使用。还需注意，胶束脂质对温度敏感，因此可能需要优化核磁共振样品的温度。在完成此操作后，还可采用其他技术，如全内反射显微镜和电子显微镜，以研究发生坏死性凋亡的细胞其细胞破裂的速度以及破裂在质膜上的定位位置。

此外，可采用微尺度热泳技术对MLKL与胶束脂质的结合进行正交验证。本视频中介绍的技术为坏死性凋亡领域的研究人员探索MLKL在细胞膜破裂执行过程中的作用奠定了基础。请注意，使用氯仿具有极高的危险性，在进行该实验操作时，务必采取佩戴手套、在通风良好的环境中操作等安全防护措施。